仙茅酒蒸炮制工藝研究△

張一美，王巍，李利華，朱琳，鞠成國，2*

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；

2.國家中醫(yī)藥管理局 中藥炮制技術(shù)傳承基地，遼寧 大連 116600

仙茅為石蒜科植物仙茅Curculigo orchioidesGaertn.的干燥根莖，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛寒濕的功效[1]。仙茅始載于《雷公炮炙論》，常用于腎陽不足、陽痿精冷、筋骨痿軟、腰膝冷痛、寒虛崩漏、帶下、癆虛內(nèi)傷等臨床現(xiàn)象[2]。仙茅的化學(xué)成分主要包括酚及酚苷類、桉烷類、黃酮類、多糖類、木脂素類、生物堿類、揮發(fā)油、甜味蛋白等[3]。現(xiàn)代藥理研究表明，仙茅具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松[4]、抗關(guān)節(jié)炎、抗腫瘤、保肝[5]和抗炎[6]等作用，臨床上多用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性腎炎、骨質(zhì)疏松癥、腎陽不足所致的陽痿早泄及更年期綜合征等疾病[7]。

歷代仙茅炮制方法主要有藥汁制、泔水制、酒炒、酒浸、酒蒸等[8]。與古代炮制方法相比，現(xiàn)代炮制方法以酒炙法為主，其他方法已很少用或不用。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，仙茅在經(jīng)過酒炙后其補(bǔ)腎助陽的功效增強(qiáng)[9]。但傳統(tǒng)酒炙法僅憑經(jīng)驗(yàn)對炒制火候、炒制時間等條件進(jìn)行控制，存在火候難以控制、炒制時間過長或不足、色澤不均勻等弊端。而酒蒸法能較好地控制炮制溫度和時間等。中藥蒸制方法歷史悠久，可追溯至春秋戰(zhàn)國時期，《五十二病方》中有中藥“清蒸”的記載[10]。至南北朝時期，《雷公炮炙論》中增加了“酒蒸”的記載[11]。《景岳全書》對仙茅有“用酒拌蒸之”的記載[12]，蒸制后藥物的不良反應(yīng)和毒性有所減少或消除。中藥蒸制的目的除了沿襲明清時期的觀點(diǎn)——增強(qiáng)藥效、減少不良反應(yīng)、改變及緩和藥性、便于切制等，還增加了保持藥效、利于貯存等目的。

仙茅補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的有效成分以酚苷類化合物為主，仙茅苷是其發(fā)揮補(bǔ)肝腎作用的有效成分之一[13]。《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版中規(guī)定以仙茅苷為指標(biāo)性成分進(jìn)行仙茅的質(zhì)量控制[1]。仙茅中含量較高的成分有苔黑酚龍膽二糖苷和苔黑酚葡萄糖苷等，其為仙茅發(fā)揮強(qiáng)筋骨作用的有效成分[14]。本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以加酒量、悶潤時間、蒸制時間為考察因素，以仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷及醇溶性浸出物含量為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選酒蒸仙茅炮制工藝，以期為酒蒸仙茅飲片的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化、工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

C21-WT2118 型電磁爐（美的集團(tuán)股份有限公司）；DFT-200 型高速萬能粉碎機(jī)（浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；XMTD-8222 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、FA1004B 型萬分之一電子天平（上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；AE240型十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250E 型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海江星儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品仙茅苷（批號：S0818AS，純度＞98%）、苔黑酚龍膽二糖苷（批號：J1014AS，純度＞98%）均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；苔黑酚葡萄糖苷（北京索萊寶科技有限公司，批號：1206A022，純度≥98%）；黃酒（浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，批號：20210119，酒精度：10%）；乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純；娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

仙茅樣品（批號：2208001）購自安國市聚藥堂藥業(yè)有限公司，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定室李峰教授鑒定為石蒜科植物仙茅Curculigo orchioidesGaertn.的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 酒制仙茅的制備

2.1.1 傳統(tǒng)酒炙法 取生仙茅飲片20 g，置密閉容器內(nèi)，加入黃酒（每100 kg 飲片加入黃酒10 kg）拌勻，悶潤，待黃酒被吸盡后，置鍋中，以文火炒干，取出，放涼，即得[15]。

2.1.2 酒蒸法 取生仙茅飲片20 g，置密閉容器內(nèi)，加入黃酒（每100 kg 飲片加入黃酒20 kg）拌勻，悶潤1 h，置鍋中，蒸制1 h，取出放涼，50 ℃干燥，即得。

2.2 醇溶性浸出物的測定

按《中國藥典》2020 年版通則2201 項(xiàng)下醇溶性浸出物測定法中的熱浸法進(jìn)行測定[16]。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件 1）仙茅苷：Xtimate C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以0.1%磷酸水溶液-乙腈（76∶24）為流動相；流速為1 mL·min-1；檢測波長為210 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL[17]。2）苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷：Xtimate C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～7 min，95%～90%B；7～20 min，90%B）；流速為0.6 mL·min-1；檢測波長為220 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL[17]。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷對照品適量，分別加入甲醇溶解稀釋，混勻，制得仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷、苔黑酚龍膽二糖苷質(zhì)量濃度分別為0.245 0、0.572 5、1.377 5 mg·mL-1的單一對照品母液[17]備用。

2.3.3 供試品溶液的制備 取2.1.2 項(xiàng)下酒蒸仙茅樣品粉末（過三號篩，下同）1.0 g，精密稱定，加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，于水浴鍋中加熱回流2 h，取出放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取上述濾液20 mL，蒸干，殘?jiān)尤爰状紡?fù)溶，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。同法制得仙茅生品及酒炙品的供試品溶液。

2.3.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述各供試品溶液及單一對照品溶液適量，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（圖1）。

2.3.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.3.2 項(xiàng)下各單一對照品母液適量，用甲醇稀釋，制成仙茅苷質(zhì)量濃度分別為7.70、15.30、30.60、61.30、122.50、245.00 μg·mL-1，苔黑酚龍膽二糖苷質(zhì)量濃度分別為17.89、35.78、71.56、143.10、286.30、572.50 μg·mL-1，苔黑酚葡萄糖苷質(zhì)量濃度分別為 43.00、86.10、172.20、344.40、688.80、1 377.50 μg·mL-1的各單一對照品線性溶液，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以各待測成分進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 仙茅中3個成分線性關(guān)系

2.3.6 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取2.3.2 項(xiàng)下各單一對照品溶液適量，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷峰面積的RSD 分別為0.44%、0.30%、0.27%，表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.3.3 項(xiàng)下供試品溶液（仙茅生品）適量，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷峰面積的RSD 分別為0.13%、0.37%、0.21%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取仙茅生品樣品粉末 1.0 g，共6 份，按2.3.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.099%、0.387%、0.649%，RSD 分別為0.36%、0.54%、0.30%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6 份已知含量的同一批仙茅樣品（生品）粉末，每份0.1 g，分別加入各單一對照品溶液適量，按2.3.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 仙茅中3個成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 單因素試驗(yàn)

本研究選擇加酒量、悶潤時間、蒸制時間進(jìn)行單因素試驗(yàn)。同時，參考文獻(xiàn)[17-19]確定各因素的權(quán)重，3 個化學(xué)成分及醇溶性浸出物含量的權(quán)重均為25%。按公式（1）計(jì)算綜合評分。

式中W表示仙茅苷含量，X表示苔黑酚葡萄糖苷含量，Y表示苔黑酚龍膽二糖苷含量，Z表示醇溶性浸出物含量，綜合評分分值越高表示樣品質(zhì)量越好[20]。

2.4.1 加酒量 取5 份生仙茅飲片，每份20 g，加入不同比例黃酒，至密閉容器內(nèi)悶潤3 h 后，蒸制2 h，取出放涼，50 ℃干燥。考察不同加酒量（5%、10%、15%、20%、25%）對綜合評分的影響。當(dāng)加酒量為15%時，綜合評分最高，故選擇加酒量10%～20%進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表3。

表3 不同加酒量對酒蒸仙茅中3個成分及浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、綜合評分的影響

2.4.2 悶潤時間 取5 份生仙茅飲片，每份20 g，加入15%黃酒，至密閉容器內(nèi)悶潤不同時間后，蒸制2 h，取出放涼，50 ℃干燥。考察不同悶潤時間（1、2、3、4、5 h）對綜合評分的影響。當(dāng)悶潤時間為1 h時，綜合評分最高，悶潤時間少于1 h時存在不能完全潤透的情況，而悶潤2 h或3 h時綜合評分較高，故選擇悶潤時間1～3 h進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表4。

表4 不同悶潤時間對酒蒸仙茅中3個成分及浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、綜合評分的影響

2.4.3 蒸制時間 取5份生仙茅飲片，每份20 g，加入15%黃酒，至密閉容器內(nèi)悶潤1 h，蒸制不同時間，取出放涼，50 ℃干燥。考察不同蒸制時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對綜合評分的影響。當(dāng)蒸制時間為1.0 h時，綜合評分最高，其次為1.5、2.0 h，而蒸制時間少于1.0 h時，不能完全蒸透，故選擇蒸制時間1.0～2.0 h進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表5。

表5 不同蒸制時間對酒蒸仙茅中3個成分及浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、綜合評分的影響

2.5 正交試驗(yàn)

2.5.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究以加酒量（A）、悶潤時間（B）、蒸制時間（C）為考察因素，仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷和醇溶性浸出物含量的綜合評分為評價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）設(shè)計(jì)試驗(yàn)。酒蒸仙茅炮制工藝的因素與水平見表6，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表7，方差分析結(jié)果見表8。

表6 酒蒸仙茅炮制工藝正交試驗(yàn)因素水平

表7 酒蒸仙茅炮制工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

表8 酒蒸仙茅炮制工藝正交試驗(yàn)方差分析

由表7可知，各因素對3個酚苷類成分和醇溶性浸出物含量影響為A＞B＞C，最優(yōu)組合為A3B2C3。由表8 可知，因素A、B、C 影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為節(jié)約時間，最終確定最優(yōu)工藝為A3B1C1，即加酒量20%、悶潤時間1 h、蒸制時間1 h。

2.5.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 取3 份生仙茅飲片，每份100 g，按上述最優(yōu)酒蒸炮制工藝制備3 批酒蒸仙茅樣品，再按2.2、2.3 項(xiàng)下方法分別測定含量，并計(jì)算綜合得分，結(jié)果見表9。綜合評分的RSD為0.71%，表明所得最優(yōu)酒蒸仙茅工藝穩(wěn)定、可行。

表9 酒蒸仙茅炮制工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 仙茅生品、酒炙品及酒蒸品含量比較

取生仙茅飲片20 g，分別按2.1.1、2.1.2 項(xiàng)下方法分別制備酒炙品和酒蒸品，再按2.2、2.3 項(xiàng)下方法分別測定生仙茅飲及2 種炮制品中仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷、苔黑酚龍膽二糖苷和醇溶性浸出物的含量，結(jié)果見表10。結(jié)果顯示，酒蒸仙茅的仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷及醇溶性浸出物含量均高于仙茅生品和酒炙品。

表10 仙茅生品、酒炙品及酒蒸品中仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷、苔黑酚龍膽二糖苷、浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較 %

3 討論

漢代開始陸續(xù)出現(xiàn)了酒制中藥的方法，近幾十年來，對于酒制中藥的研究一直在持續(xù)進(jìn)行。現(xiàn)代較為常用的酒制法包括酒炙、酒蒸、酒淬等。酒制中藥所用的輔料酒分為黃酒和白酒，現(xiàn)代中藥在酒制時，以黃酒為主。黃酒氣味芳香、主行藥勢、能入血分、可通血脈、能升能散，有活血通絡(luò)、和血行氣、散寒祛腥的作用[21]。炮制用輔料黃酒應(yīng)該清亮透明、無沉淀雜質(zhì)，不應(yīng)有異味，顏色應(yīng)為橙黃至深褐色。黃酒中含有醇，醇有促進(jìn)血液循環(huán)、興奮心臟等作用。酒制中藥時，黃酒與中藥充分拌勻潤透，可滲入組織內(nèi)部，對中藥內(nèi)部組織的物理狀態(tài)有所改變，對成分的溶解、擴(kuò)散、置換、溶出等有促進(jìn)作用，酒制傳統(tǒng)炮制理論有“借酒力以上騰也”“酒制升提”等[15]。

基于“相資為制”的制藥理論，以熱性的黃酒炮制熱性的仙茅，能夠增強(qiáng)仙茅補(bǔ)腎溫陽的作用。目前，《中國藥典》2020 年版對于仙茅的炮制方法也以酒炙法為主，對酒蒸仙茅的研究較少。但酒炙法存在火力不均、火候難以控制等問題，而酒蒸法則能使飲片受熱均勻，且由于其操作過程中處于密閉環(huán)境，減少了對飲片的污染。故本研究選擇對酒蒸仙茅炮制工藝進(jìn)行研究，以期提高其臨床療效和用藥安全性，為臨床用藥提供新思路。

本研究經(jīng)實(shí)驗(yàn)考察，以本課題組前期研究為參考[17]，發(fā)現(xiàn)以2.3.1項(xiàng)下色譜條件測定仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷含量時，其色譜峰分離度較好、基線較為平穩(wěn)。故選擇以2.3.1 項(xiàng)下色譜條件對其進(jìn)行檢測。

本研究采用酒蒸法，以加酒量、悶潤時間、蒸制時間為考察因素，結(jié)合綜合加權(quán)評分對工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到仙茅酒蒸最佳工藝為加酒量20%，悶潤時間1 h，蒸制時間1 h。經(jīng)驗(yàn)證，所得最優(yōu)酒蒸仙茅炮制工藝具有一定的科學(xué)性與可行性。仙茅經(jīng)酒蒸后，與仙茅生品及傳統(tǒng)酒炙品相比，其醇溶性浸出物及3 個成分含量均有所升高。這可能是由于在炮制過程中，黃酒進(jìn)入仙茅內(nèi)部，促進(jìn)其有效成分的溶出、仙茅中的其他化學(xué)成分發(fā)生了轉(zhuǎn)化等，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

酒蒸仙茅的炮制方法在明代的《景岳全書》[12]、現(xiàn)代的《遼寧省中藥飲片炮制規(guī)范》1975 年版[22]及《云南省中藥飲片炮制規(guī)范》1986 年版[23]中均有記載，但其炮制工藝各不相同。由于炮制工藝變化較大，且中藥成分較為復(fù)雜，故本研究選擇對仙茅酒蒸工藝進(jìn)行優(yōu)化。現(xiàn)代對生仙茅及酒炙仙茅臨床應(yīng)用記載較多，而對酒蒸仙茅臨床應(yīng)用卻鮮有記載，故后續(xù)尚需對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、藥理實(shí)驗(yàn)、化學(xué)成分分析、臨床療效等進(jìn)行更深入的研究，以期為酒蒸仙茅臨床應(yīng)用提供參考。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。