基于高通量測(cè)序分析建曲發(fā)酵過(guò)程中微生物多樣性變化△

譚斯尹，潘禮業(yè)，羅宇琴，李國(guó)衛(wèi)*，陳向東，孫冬梅，張軍

1.廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244；

2.廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244

建曲始載于清代《藥性考》[1]，產(chǎn)自福建泉州，又名泉州神曲、百草曲、范志神曲，其制作始于明、清年間，已有四百多年歷史，清朝趙子敏、陳修園等名醫(yī)均著書(shū)詳述[2]。《本草綱目拾遺》曰：“建曲出福建泉州府開(kāi)元寺造者佳，此由采百草號(hào)成，故又名百草曲……福建泉州府城內(nèi)范志昊亦飛馳名萬(wàn)應(yīng)神曲……店住學(xué)院考棚邊桂壇巷內(nèi)，觀音亭頂南畔第三間，范志吳牌匾記。”[3]建曲有調(diào)胃健脾、消積進(jìn)食、和中解酒、止瀉利水的作用，常用于治療四時(shí)不正之氣、感冒發(fā)熱、頭眩咳嗽及傷食腹痛、痞滿氣痛、嘔吐瀉泄痢疾、飲食不進(jìn)等癥[3]。

根據(jù)《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》中建曲的制備方法，將廣藿香、蒼術(shù)、厚樸等23 味藥與麥麩、面粉混勻后制成方塊，經(jīng)自然發(fā)酵后干燥而得[4]。從現(xiàn)代微生物學(xué)的角度，建曲的發(fā)酵過(guò)程實(shí)質(zhì)是微生物生長(zhǎng)、演替、互作和代謝的過(guò)程，通過(guò)微生物和酶的催化與分解，使藥物發(fā)泡、生衣，微生物產(chǎn)生的次生代謝物、蛋白酶、消化酶和低聚糖等新的活性成分為建曲的功能藥效提供了必要的支持；低聚糖、單糖等成分能協(xié)助腸胃發(fā)揮正常功能、預(yù)防胃炎和腸胃潰瘍[5-6]。在歷代《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）中，建曲均以“遍起白霉，有酒香氣”為其發(fā)酵炮制終點(diǎn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)，人為主觀因素影響較大，況且有些廠家為了美觀會(huì)將建曲發(fā)酵終點(diǎn)提前，并未達(dá)到“遍起白霉”的發(fā)酵程度，無(wú)法保證用藥安全[7]。此外，自然發(fā)酵由于不同時(shí)期的溫濕度和發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)存在差異，造成發(fā)酵產(chǎn)物和微生物種類和數(shù)量不可控，導(dǎo)致同一產(chǎn)地不同批次或不同產(chǎn)地的建曲藥效和品質(zhì)存在差異。

利用優(yōu)勢(shì)菌種建立的發(fā)酵工藝，可改善自然發(fā)酵中雜菌多、時(shí)間長(zhǎng)等不穩(wěn)定性[8]。目前，關(guān)于建曲發(fā)酵菌群的研究較少[7,9]，尤其有關(guān)建曲中真菌的群落結(jié)構(gòu)研究鮮有報(bào)道。因此，本研究參照《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》，以自然發(fā)酵條件下符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的建曲為研究對(duì)象，從發(fā)酵微生物角度進(jìn)行定性表征，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，揭示了在同一發(fā)酵條件下，建曲發(fā)酵過(guò)程中微生物結(jié)構(gòu)和功能的變化，以及優(yōu)勢(shì)物種，明確了建曲發(fā)酵中的主要功能微生物，為后續(xù)建立穩(wěn)定可控的建曲現(xiàn)代發(fā)酵工藝提供參考。

1 材料

1.1 樣品

建曲原料藥材（辣蓼、蒼耳草、青蒿、苦杏仁、赤小豆、麥芽、炒山楂、陳皮、廣藿香、蒼術(shù)、厚樸、川木香、白芷、檳榔、麩炒枳殼、紫蘇、薄荷、谷芽、官桂、香附、甘草）來(lái)自廣東一方制藥有限公司，經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定，均符合《中國(guó)藥典》2020 年版及《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2010年版的規(guī)定，樣品信息見(jiàn)表1。

表1 建曲原料藥材信息

1.2 試藥

FastDNA ? Spin Kit for Soil 試劑盒（批號(hào)：116560200-CF，MP Biomedicals 公司）；TransStart Fastpfu DNA 聚合酶（批號(hào)：AP221-01，TransGen公司）；AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（批號(hào)：APGX-250，AXYGEN 公司）；TruSeqTM DNA Sample Prep Kit（批號(hào)：FC-121-3001，Illumina公司）。

1.3 儀器

Nanodrop2000 型微量紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)（Thermo Scientific公司）；GeneAmp? 9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（Applied Biosystems公司）；Quanti Fluor? -ST型藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）。

2 方法

2.1 樣品制備

參照《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》中建曲的制備方法[4]，除麥麩、面粉外，將其余辣蓼等21 味藥材粉碎成細(xì)粉，與麥麩混勻，過(guò)三號(hào)篩，再將面粉制成適量稀糊，趁熱與上述藥粉揉合均勻，以手捏成團(tuán)，擲之即散為宜，制成方塊，塊間留有空隙，上蓋麻袋，藥塊置密閉室內(nèi)自然發(fā)酵3 d（發(fā)酵結(jié)束點(diǎn)為72 h），至藥塊遍起白霉，有酒香氣時(shí)取出，炕干。隨后，分別在0、8、16、24、32、40、48、56、64、72 h 進(jìn)行取樣，每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)分別隨機(jī)取3 個(gè)平行樣品，用無(wú)菌手術(shù)刀切取樣品2～3 g，切下的樣品放置于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 樣品總DNA提取

建曲樣品用FastDNA? Spin Kit for Soil試劑盒進(jìn)行提取，用Nanodrop2000型微量紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和純度，于-80 ℃保存。

2.3 Illumina MiSeq高通量測(cè)序

樣品送至上海美吉生物公司進(jìn)行高通量測(cè)序。基于Illumina MiSeq 測(cè)序平臺(tái)，利用16S rRNA（338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAG CAG-3'和806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）和ITS（ITS1F：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAA GTAA-3'和ITS2R：5'-GCTGCGTTCTTCATCGATG C-3'）通 用引物進(jìn)行雙末端測(cè)。

2.4 數(shù)據(jù)分析

利用美吉生物云平臺(tái)（https://www.majorbio.com/web/www/index）對(duì)樣品序列按最小序列數(shù)進(jìn)行抽平化后，利用QIIME 1.9.1 軟件過(guò)濾低質(zhì)量序列和去除嵌合體，獲得有效序列。利用Usearch 11 軟件對(duì)操作分類單元（OTUs）進(jìn)行聚類，聚類標(biāo)準(zhǔn)為核苷酸序列相似度＞97%。利用Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://rdp.cme.msu.edu/）和Unite數(shù)據(jù)庫(kù)（http://unite.ut.ee/index.php）分別對(duì)每個(gè)OTU 的代表性16S rRNA和ITS 基因序列的分類學(xué)位置進(jìn)行分析，置信閾值為70%。利用Mothur 1.30.2 軟件對(duì)包括Shannon、Chao1和Good's coverage 在內(nèi)Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行計(jì)算。用Canoco 5.0 軟件進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的非度量多維尺度分析（NMDS），并用ANOSIM/Adonis基于Bray-Crutis距離計(jì)算樣品間群落組成的差異性。運(yùn)用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)分析組間物種豐度的差異。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均利用SPSS v25.0 軟件計(jì)算，顯著性水平閾值為P＜0.05。使用PICRUSt 1.1.0 軟件對(duì)OTU 豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)京都基因與基因組百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG，http://www.genome.jp/kegg/）對(duì)菌群代謝功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 物種注釋

從30個(gè)建曲發(fā)酵樣品DNA測(cè)序中共獲得1 695 154條真菌有效序列，平均長(zhǎng)度為232 bp，522 個(gè)OTUs（表2）；共獲得1 563 314 條細(xì)菌有效序列，平均長(zhǎng)度為414 bp，457 個(gè)OTUs（表3）。基于OTU 的Alpha 多樣性分析可知，所有樣品真菌和細(xì)菌的Good's coverage 分別為99.82%～100.00% 和97.04%～99.53%，表明測(cè)序數(shù)據(jù)可真實(shí)反映樣本的微生物多樣性。

表2 30個(gè)建曲發(fā)酵樣品中真菌的Illumina測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析（±s,n=3）

注：與0 h比較，*P＜0.05，#P＜0.01；表3同。

表3 30個(gè)建曲發(fā)酵樣品中細(xì)菌的Illumina測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析（±s,n=3）

表3 30個(gè)建曲發(fā)酵樣品中細(xì)菌的Illumina測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析（±s,n=3）

本研究通過(guò)Shannon 指數(shù)和Chao 指數(shù)來(lái)表示菌群的多樣性和豐富度。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，建曲的真菌群落多樣性（P＜0.05）和豐富度（P＜0.05）顯著比細(xì)菌的高。發(fā)酵前24 h（0～24 h）的真菌和細(xì)菌群落多樣性（P＜0.05）和豐富度（P＜0.05）顯著比發(fā)酵后32 h（32～72 h）高。隨著發(fā)酵時(shí)間推移，真菌群落多樣性和豐富度呈下降趨勢(shì)，而細(xì)菌群落多樣性和豐富度則先降后升，表明了在建曲發(fā)酵過(guò)程中真菌和細(xì)菌群落存在明顯演替現(xiàn)象。

3.2 建曲發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)特征

在屬水平上（圖1A），建曲真菌的優(yōu)勢(shì)類群為曲霉菌屬（Aspergillus），占總真菌的36.57%。發(fā)酵前24 h，真菌群落組成變化較小，主要由曲霉菌屬（平均相對(duì)豐度為17.21%）、鏈格孢霉菌屬（Alternaria，10.82%）、鐮刀霉菌屬（Fusarium，8.87%）、枝孢菌（Cladosporium，7.17%）、赤霉菌屬（Gibberella，5.33%）和節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia，4.84%）等真菌組成。自發(fā)酵后32 h，真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生較大的變化，曲霉菌屬的相對(duì)豐度隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而增加（49.49%，P＜0.05），而鏈格孢霉菌屬（2.44%，P＜0.05）、鐮刀霉菌屬（3.34%，P＜0.05）、枝孢菌屬（2.48%，P＜0.05）、赤霉菌屬（1.67%，P＜0.05）等主要真菌類群的相對(duì)豐度則減少。

圖1 屬水平上建曲真菌和細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)

對(duì)于細(xì)菌群落其變化趨勢(shì)與真菌相似（圖1B），細(xì)菌群落組成同樣在發(fā)酵前24 h 變化較小，但種類較單一。建曲中主要由泛菌屬（Pantoea）、魏斯菌屬（Weissella）、紅球菌屬（Rhodococcus）、片球菌屬（Pediococcus）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）組成，其中泛菌屬作為優(yōu)勢(shì)類群占總細(xì)菌的17.45%。發(fā)酵前24 h 的優(yōu)勢(shì)類群為泛菌屬（24.32%）和紅球菌屬（29.65%），發(fā)酵后32 h 到結(jié)束，兩者相對(duì)豐度下降（P＜0.05），分別占總細(xì)菌的12.87%和4.78%，但魏斯菌屬（25.27%）、片球菌屬（19.52%）和不動(dòng)桿菌屬（18.01%）的相對(duì)豐度明顯增加，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，不動(dòng)桿菌屬成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度達(dá)到36.71%。

在種水平上（圖2A），建曲真菌的變化趨勢(shì)與屬水平相似，主要由溜曲霉Aspergillus tamarii、小菌核曲霉Aspergillus minisclerotigenes、unclassifiedAspergillus和unclassifiedAlternaria這4 種真菌組成。發(fā)酵前24 h，溜曲霉和小菌核曲霉均不是優(yōu)勢(shì)物種，但兩者在合適的發(fā)酵條件下快速繁殖，在發(fā)酵后32 h 成為最優(yōu)勢(shì)菌群，分別占總真菌的22.30%和21.19%，而unclassifiedAspergillus（3.90%，P＜0.05）、unclassifiedAlternaria（2.41%，P＜0.05）、unclassifiedFusarium，（3.08%，P＜0.05）和Cladosporium delicatulum（2.21%，P＜0.05）等 真菌相對(duì)豐度則減少（P＜0.05）。

對(duì)于細(xì)菌群落（圖2B），與屬水平上的變化趨勢(shì)相似。發(fā)酵前24 h，建曲細(xì)菌由紅串紅球菌Rhodococcus erythropolis（29.56%）和unclassifiedPantoea（23.02%）占主要優(yōu)勢(shì)。發(fā)酵后32 h，紅串紅球菌（4.69%，P＜0.05）和未分類泛菌屬（2.57%，P＜0.05）相對(duì)豐度顯著下降，而類腸膜魏斯 菌Weissella paramesenteroides、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus和約氏不動(dòng)桿菌Acinetobacter johnsonii迅速成為優(yōu)勢(shì)類群，分別占總細(xì)菌的25.24%、19.52%和13.99%，發(fā)酵結(jié)束時(shí)約氏不動(dòng)桿菌占24.84%，成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌。

基于OTU水平的NMDS分析可知（圖3），發(fā)酵前24 h 的建曲真菌（P＜0.05）和細(xì)菌（P＜0.05）群落與發(fā)酵后32 h的群落分別沿第二軸和第一軸分開(kāi)，且不同發(fā)酵時(shí)間的建曲真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這些聚類趨勢(shì)與Alpha 多樣性指數(shù)（表2、表3）、微生物群落（圖1、圖2）結(jié)果一致，說(shuō)明了發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致建曲微生物群落結(jié)構(gòu)變化。

圖3 基于OTU水平的建曲真菌和細(xì)菌群落的NMDS分析

3.3 建曲發(fā)酵過(guò)程中微生物群落組成比較

通過(guò)韋恩圖分析建曲不同發(fā)酵時(shí)期所共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目（圖4）。從分析結(jié)果可以看出，10組建曲樣品中真菌和細(xì)菌的OTUs 總共97 個(gè)和77 個(gè)，其中共有OTUs 數(shù)目分別為97 個(gè)和31 個(gè)。值得注意的是，真菌特有的OTUs 數(shù)為0 個(gè)，而細(xì)菌特有的OTUs 數(shù)為46 個(gè)，主要集中在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，其特有的OTUs數(shù)為31個(gè)，其占細(xì)菌OTUs總數(shù)的40.26%。表明了盡管不同發(fā)酵時(shí)期建曲中的真菌的優(yōu)勢(shì)類群有所變化，但其菌群種類基本一致，而細(xì)菌種類則在發(fā)酵結(jié)束出現(xiàn)較大變化。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)期建曲真菌和細(xì)菌中共有的和特有的OTU數(shù)分析

3.4 建曲微生物群落功能預(yù)測(cè)分析

使用PICRUSt 對(duì)真菌進(jìn)行功能分類有助于理解建曲在發(fā)酵中化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化過(guò)程。從圖5 可知，真菌和細(xì)菌的功能代謝變化趨勢(shì)與其群落結(jié)構(gòu)變化一致。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程，真菌中具有氧呼吸代謝功能的類群占比最高（10.61%），細(xì)菌則是具有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（transporters、ABC transporters）的類群最高（11.74%）。發(fā)酵前24 h，真菌和細(xì)菌的功能變化不明顯。發(fā)酵后32 h，尤其在發(fā)酵56 h 到結(jié)束階段，真菌中具有脂肪酸的β-氧化（fatty acid β-oxidation）功能、甲基酮生物合成（methyl ketone biosynthesis）功能、甘露糖生物合成（GDPmannose biosynthesis）功能、磷酸泛酸生物合成（phosphopantothenate biosynthesis Ⅰ）功能等相對(duì)豐度顯著升高（P＜0.05）；而細(xì)菌主要是DNA 修復(fù)與重組蛋白（DNA repair and recombination proteins）、嘌呤代謝功能（purine metabolism）增加。在發(fā)酵40 h 時(shí)，細(xì)菌中有關(guān)氨基酸合成代謝活躍，如核糖體功能（ribosome）、DNA 復(fù)制蛋白（DNA replication proteins）、丙酮酸代謝（pyruvate metabolism）、氨基糖和核苷酸糖代謝（amino sugar and nucleotide sugar metabolism）等功能的相對(duì)豐度均明顯增加，這與類腸膜魏斯菌和紅串紅球菌相對(duì)豐度迅速上升有關(guān)。表明了建曲中含有豐富的代謝途徑相關(guān)的真菌和細(xì)菌功能基因，而且不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)部分微生物所發(fā)揮的功能也不同。

圖5 真菌和細(xì)菌的基因功能預(yù)測(cè)熱圖

4 討論

傳統(tǒng)微生物分離技術(shù)是在特定的條件下利用培養(yǎng)基對(duì)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，方便直觀，由于環(huán)境條件的改變和微生物的自然協(xié)作方式改變[10]，使得很多菌類無(wú)法培養(yǎng)，難以全面反映樣品中整個(gè)微生物的結(jié)構(gòu)情況，可能還會(huì)使得一些具有重要生物功能的微生物資源被忽視[11]。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛應(yīng)用到環(huán)境、生物、食品等微生物多樣性研究中，也逐漸成為中藥微生物資源研究的熱門手段，如三七[12]、霍山石斛[13]、黃芪[14]等。本研究采用Illumina 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)發(fā)酵中建曲的真菌和細(xì)菌菌群進(jìn)行鑒定，系統(tǒng)地揭示了建曲的微生物群落結(jié)構(gòu)，初步了解建曲在發(fā)酵過(guò)程中菌群的變化與差異。

本研究共獲得真菌和細(xì)菌的有效序列為3 258 468條，充分反映了建曲發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)。Alpha 多樣性分析顯示（表2、表3），建曲的真菌群落有較高的多樣性和豐富度，與袁學(xué)剛等[15]對(duì)連梔礬溶液發(fā)酵炮制過(guò)程中真菌菌群的研究結(jié)果相似，表明建曲發(fā)酵過(guò)程主要由真菌主導(dǎo)。群落結(jié)構(gòu)分析（圖1）顯示，建曲中的真菌主要由曲霉屬組成，細(xì)菌主要由泛菌屬、魏斯菌屬、紅球菌屬、片球菌屬和不動(dòng)桿菌屬組成，與廖茜[9]的研究結(jié)果不同，其發(fā)酵中的建神曲主要由乳桿菌Lactobacillus、綠膿桿菌Pseudomonas、芽孢桿菌Bacillus、假黃色單胞菌屬Pseudoxanthomonas等12 種細(xì)菌屬組成，可能是由于建曲原料帶有的菌種和發(fā)酵環(huán)境的不同，導(dǎo)致獲得的微生物類群也不同。在發(fā)酵前24 h 的真菌和細(xì)菌種類均比發(fā)酵后32 h 多，進(jìn)入發(fā)酵階段后優(yōu)勢(shì)菌群逐漸顯現(xiàn)（圖1、圖2），這與陳彥琳等[5]的研究結(jié)果一致，反映了發(fā)酵初期建曲原料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，各類群處于均衡狀態(tài)，自帶的物種多樣性較高。到了發(fā)酵中后期，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)開(kāi)始減少，各類群開(kāi)始掠奪養(yǎng)分，種內(nèi)外斗爭(zhēng)激烈，且建曲中的辣蓼、蒼耳草、青蒿等藥材有抑菌作用，這些藥物成分在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)微生物存在自然選擇作用，使得整個(gè)發(fā)酵過(guò)程存在明顯的菌群演替現(xiàn)象。

本研究發(fā)現(xiàn)建曲中有較多真菌具有降解生物質(zhì)的能力，如鐮刀菌屬能產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶[16]、根霉菌屬具有極強(qiáng)的蛋白質(zhì)分解能力[17]等。其中，真菌的優(yōu)勢(shì)類群為曲霉屬，其微生物分泌酶系最廣泛，是目前酶制劑生產(chǎn)和工業(yè)發(fā)酵的最主要菌株，提高了發(fā)酵物中大分子物質(zhì)向小分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)化速度[18]。而其中的優(yōu)勢(shì)物種為溜曲霉和小菌核曲霉，溜曲霉屬于殼霉目（Discellaceae）杯霉科（Aspergullus）曲霉屬，主要生長(zhǎng)在腐霉物、土壤、塑料管等各種不同基質(zhì)上[19]。目前，關(guān)于溜曲霉和小菌核曲霉的次生代謝產(chǎn)物的研究較少，溜曲霉的代謝產(chǎn)物主要為生物堿和環(huán)肽類化合物，從浮木中的溜曲霉分離得到的五環(huán)辛吲哚類生物堿具有Ca2t-ATPase 抑制活性、組蛋白去乙酰化酶抑制活性和對(duì)藤黃微球菌Mycrococcus luteus的抗菌活性[20]；與藥用植物內(nèi)共生的溜曲霉的活性物質(zhì)主要為吲哚二酮哌嗪生物堿類化合物，該生物堿家族中具有很多抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用[21]。此外，溜曲霉具有果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶等多種酶系統(tǒng)，可通過(guò)纖維素產(chǎn)生蛋白[22]，而建曲中含有大量的纖維素，促進(jìn)了該菌的生長(zhǎng)和物質(zhì)代謝，正因?yàn)榱锴购推渌旱拇x產(chǎn)物功能多樣，使得建曲發(fā)揮著多種治療藥效。由于建曲屬于多藥材混合發(fā)酵，含有多種活性物質(zhì)，發(fā)酵中菌群結(jié)構(gòu)的變化會(huì)對(duì)建曲中的藥效成分產(chǎn)生不可避免的影響，且單一的特定菌種并不能達(dá)到混合菌種發(fā)酵的互補(bǔ)優(yōu)勢(shì)。后續(xù)可嘗試?yán)脙?yōu)勢(shì)真菌溜曲霉、小菌核曲霉、優(yōu)勢(shì)細(xì)菌約氏不動(dòng)桿菌等菌種接種到建曲中，進(jìn)行單獨(dú)和混合發(fā)酵，減少雜菌生長(zhǎng)，縮短發(fā)酵周期，考察建曲的活性物質(zhì)和藥效的變化，探索建曲質(zhì)量和藥效更為穩(wěn)定的發(fā)酵工藝方法。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。