基于指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學的經(jīng)典名方三化湯質(zhì)量標志物預測△

倪天婷，談仲川，梅佳鈺，羅鑫，朱靚婷，高潔，干國平，2*

1.湖北中醫(yī)藥大學 藥學院，湖北 武漢 430065；

2.湖北省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430065

經(jīng)典名方是古代醫(yī)家長期臨床實踐經(jīng)驗的結(jié)晶，已成為我國中藥新藥研發(fā)的重要源泉[1]。三化湯出自劉完素《素問病機氣宜保命集》[2]，收載于《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》[3]，處方由大黃、枳實、厚樸、羌活4 種藥味組成，具有祛風瀉熱、清熱通便、通腑導滯功效，用于治療中風入臟、大便不通等[4-5]。本課題組擬對三化湯進行新藥開發(fā)研究。

藥效成分量值傳遞規(guī)律是開發(fā)古代經(jīng)典名方過程中的重點研究內(nèi)容，首先需明確其藥效成分，但由于中藥化學成分復雜，因此需要采用中藥分析學、網(wǎng)絡(luò)藥理學等多學科交叉技術(shù)，通過多成分、多途徑、多靶點研究其藥效成分及治療作用。中藥指紋圖譜利用現(xiàn)代分析方法對中藥的藥效化合物進行表征，并將其與化學計量學結(jié)合，更客觀地反映中藥的完整性和差異性，是目前常見的發(fā)現(xiàn)共有成分和評估質(zhì)量一致性的方法[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學通過建立成分-靶點-通路的網(wǎng)絡(luò)拓撲學關(guān)系，預測藥物與疾病之間的關(guān)系，其整體性、系統(tǒng)性的特點符合中醫(yī)藥整體觀、辨證論治的原則[7]。

中藥質(zhì)量標志物（Q-marker）是以現(xiàn)代科學和生物技術(shù)為研究手段，對中藥形成全過程中的化學物質(zhì)組成及其傳遞變化規(guī)律進行鑒定和闡明，并按照可測性、特有性、傳遞與溯源、有效性和處方配伍5 項基本原則提煉得到的活性成分（群），用以建立中藥全過程質(zhì)量控制與溯源體系[8]。因此，本研究基于Q-marker 理論，整合高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜、化學計量學及網(wǎng)絡(luò)藥理學，從生物信息學和化學角度分析預測經(jīng)典名方三化湯潛在的Q-marker，為三化湯質(zhì)量控制研究提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品

15 批不同來源的大黃、枳實、厚樸、羌活均由湖北中醫(yī)藥大學楊紅兵教授鑒定，分別為藥用大黃Rheum officinaleBaill.、酸橙Citrus aurantiumL、厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils、寬葉羌活Notopterygium franchetiiH.de Boiss。利用隨機數(shù)表法將厚樸、羌活、大黃、枳實4 味藥不同批次隨機組合，樣品信息見表1。

表1 三化湯樣品各藥味批號、產(chǎn)地信息

1.2 儀器

LC-20AD 型高效液相色譜儀（島津公司）；JY/YP 5002 型電子天平（上海上天精密儀器有限公司）；30MF5 3L 型微電腦養(yǎng)生壺（潮州市潮安區(qū)龍光電器有限公司）；AS 系列超聲波清洗機（天津市特賽恩斯儀器有限公司）；HHS-2S 型電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海虞龍儀器設(shè)備有限公司）；BS210S型萬分之一天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；AB135-S型十萬分之一天平（Mettler-Toledo公司）。

1.3 試藥

對照品厚樸酚（批號：Y2TJ10191584）、和厚樸酚（批號：Y2806135149）均購于上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%；辛弗林（批號：AF21031451）、柚皮苷（批號：AF21101953）、新橙皮苷（批號：AF21082352）、紫花前胡苷（批號：AF20060610）、蘆薈大黃素（批號：AF20021623）、大黃素甲醚（批號：AF20051502）均購于成都埃法生物科技有限公司，純度≥98%；對照品橙皮苷（批號：110721-201818，純度：96.20%）、大黃素（批號：110756-201913，純度：96.0%）、大黃酚（批號：110796-201922，純度：99.4%）、大黃酸（批號：110757-201607，純度：99.3%）均購于中國食品藥品檢定研究院；色譜級甲醇、乙腈購于Sigma公司；其他試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法

2.1 色譜條件

采用YMC C18色譜柱（25 cm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.01%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，5%B；5～13 min，5%～17%B；13～36 min，17%B；36～55 min，17%～20%B；55～105 min，20%～70%B；105～115 min，70%～90%B；115～125 min，90%B；125～130 min，90%～5%B）；柱溫為30 ℃；檢測波長：0～10 min，224 nm；10～60 min，285 nm；60～80 min，310 nm；80～93 min，254 nm；93～105 min，310 nm；105～130 min，254 nm；流速為1 mL·min-1；進樣量為20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 三化湯物質(zhì)基準的制備 根據(jù)文獻考證[9-14]及本課題組前期實驗結(jié)果，確定三化湯物質(zhì)基準的制備方法：取厚樸、大黃、枳實、羌活各31 g，各藥味先切碎過3目篩，不過8目篩，加水600 mL，浸泡30 min，加蓋，用微電腦養(yǎng)生壺煎煮，武火（500 W）煎煮8 min，再用文火（200 W）煎煮約22 min，200目篩濾過，濾液定容至300 mL，即得。

2.2.2 混合對照品的制備 將精密稱量的柚皮苷、辛弗林、紫花前胡苷、橙皮苷、新橙皮苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、和厚樸酚、異歐前胡素、厚樸酚、大黃酚、大黃素甲醚對照品加乙腈-水（50∶50）制成質(zhì)量濃度分別為4 328.52、1 415.57、728.63、299.06、3 645.78、25.06、86.99、28.95、19.43、17.36、27.56、30.12、15.04 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取三化湯物質(zhì)基準5.0 mL，用乙腈-水（50∶50）混合溶劑稀釋20倍，混勻，濾過，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 減去處方中待測藥味，稱取其他3味藥物，先按2.2.1項下方法制成陰性樣品，再按2.2.3項下方法分別制成4種陰性樣品溶液。

2.2.4 對照藥材溶液的制備 分別取大黃、枳實、厚樸、羌活粗顆粒各31 g，按2.2.1 項下和2.2.3 項下方法分別制成4種對照藥材溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 參照峰選擇 在標準色譜圖中紫花前胡苷分離度好、峰面積大、峰形好且穩(wěn)定，故選擇紫花前胡苷作為參照，計算15 批三化湯物質(zhì)基準指紋圖譜中各色譜峰共有峰的相對保留時間、相對峰面積。

2.3.2 精密度試驗 取同一供試品溶液，重復進樣6 次，以紫花前胡苷為參照，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。

2.3.3 重復性試驗 按照2.2.3 項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按2.1項下色譜條件進行測定，以紫花前胡苷為參照，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品，于0、3、6、9、24 h 進行測定，以紫花前胡苷為參照，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。

2.4 指紋圖譜的建立與相關(guān)性分析

2.4.1 三化湯指紋圖譜的建立 取15 批三化湯物質(zhì)基準，按2.2.3 項下方法制備供試品溶液，進樣分析，將色譜數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版），隨機選取S1（SHT01）為參照，采用中位數(shù)法，進行多點校正和全譜峰匹配分析，生成15批三化湯指紋圖譜以及對照指紋圖譜。

2.4.2 相似度評價 將15 批三化湯色譜數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）計算相似度。

2.4.3 共有峰的確認及指紋圖譜峰歸屬 分別吸取2.2 項下制備的對照品溶液、對照藥材溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，按2.1 項下色譜條件進行測定，對指紋圖譜峰進行歸屬及指認。

2.5 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）

使用統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析軟件SIMCA 13.0 對15 批樣品的指紋圖譜進行OPLS-DA。采用變量重要性投影（VIP）值確定物質(zhì)基準影響較大的物質(zhì)。

2.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學研究

2.6.1 三化湯活性成分靶點篩選 通過ccTCM 數(shù)據(jù)庫（http://cctcm.org.cn/）搜索13 個成分的靶點，通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.nehi.nlm.nih.gov）下載指認的13 個活性成分的分子結(jié)構(gòu)式，以SMILES 形式導入SwissTargetPrediction 平臺（http://www.swisstargetprediction.ch），設(shè)置物種為“Homo sapiens”獲得蛋白質(zhì)靶點信息，設(shè)置Probability＞0，得到化合物的作用靶點。

2.6.2 疾病靶點的收集 三化湯有治療卒中、腦缺血、利尿、通便的功效，故通過GeneCards（https://www.genecards.org）、OMIM（http://www.omim.org）和DisGNET（https://www.disgenet.org）數(shù)據(jù)庫，以“stroke”“l(fā)axative”“diuresis”“cerebral ischemia”為關(guān)鍵詞進行檢索，合并得到疾病的靶點，去除重復值，得到疾病靶點。

2.6.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過韋恩圖，對2.6.1 項下收集的活性成分靶點與2.6.2項下收集的疾病靶點進行交集，將得到的交集靶點導入String 數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/），進行PPI 分析。以“Homo species”作為分析物種，“minimum required interaction score”選擇“highest confidence（0.900）”，勾 選“hide disconnected nodes in the network”項，分析并下載結(jié)果。將結(jié)果導入Cytoscape 3.10.0 軟件，利用Cyto NCA 插件對數(shù)據(jù)結(jié)果進行分析，選擇度（degree）、介度（betweenness centrality）和緊密度（closeness centrality）均大于中位數(shù)且度值＞10的靶點作為核心靶點。

2.6.4 基因本體（GO）生物學分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將38 個核心靶點導入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov），進行GO 功能分析中基因靶點的生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）和KEGG通路富集分析。以P＜0.01為篩選條件，GO 功能分析選取前10條、KEGG通路富集分析選擇前20條。

2.6.5 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將13 個成分、2.6.1 項下靶點、2.6.4 項下前20 條通路，導入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2.6.6 分子對接 通過PubChem 數(shù)據(jù)庫下載13 個活性成分的3D 結(jié)構(gòu)。在PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）中下載核心靶點的3D 結(jié)構(gòu)，導入PyMol 2.1.0 軟件對靶點蛋白進行去除配體、水。利用AutoDock 1.5.6 軟件對小分子配體和蛋白受體進行活性修飾，將處理后的小分子配體和蛋白受體進行對接運算。再導入PyMol 軟件進行作圖，得到最終的對接圖。

3 結(jié)果

3.1 方法學考察結(jié)果

3.1.1 精密度 計算得到各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 分別為0.97%～2.06%、0.77%～1.66%，結(jié)果表明，儀器精密度滿足要求。

3.1.2 重復性 計算得到各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 分別為0.81%～1.88%、0.32%～1.84%，結(jié)果表明，方法重復性良好。

3.1.3 穩(wěn)定性 計算得到各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 分別為0.84%～1.81%、0.69%～2.04%，結(jié)果表明，供試品溶液在室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2 指紋圖譜的建立與相關(guān)性分析

3.2.1 三化湯指紋圖譜的建立及相似度評價 15批三化湯樣品共得到17 個共有峰，疊加指紋圖譜及標準指紋圖譜見圖1、圖2。15 批樣品的指紋圖譜相似度均＞0.97，表明不同批次三化湯樣品的相似度較高，生產(chǎn)工藝均一穩(wěn)定。

圖1 三化湯物質(zhì)基準HPLC指紋圖譜

圖2 三化湯物質(zhì)基準標準指紋圖譜

3.2.2 三化湯共有峰歸屬及指認 通過比對供試品溶液、4 味藥陰性樣品溶液、4 味藥對照藥材溶液，對17 個共有峰進行歸屬，結(jié)果見圖3。峰1、3、4、5、6 歸屬為枳實；峰7、8、9、10、12、16、17 歸屬為大黃；峰13、15歸屬為厚樸；峰2、11、1歸屬為羌活。通過比對混合對照品溶液和三化湯物質(zhì)基準供試品溶液指紋圖譜，指認出13 個共有峰，分別為辛弗林、紫花前胡苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、厚樸酚、異歐前胡素、和厚樸酚、大黃酚、大黃素甲醚。

圖3 三化湯物質(zhì)基準HPLC指紋圖譜中色譜峰歸屬

3.3 OPLS-DA

為了探索影響物質(zhì)基準質(zhì)量差異的原因，使用統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析軟件SIMCA 13.0 對15 批樣品的指紋圖譜進行OPLS-DA。15 批樣品被明顯劃分為左右3個區(qū)域，見圖4。采用VIP值確定物質(zhì)基準影響較大的物質(zhì)，選擇VIP 值＞1.0 的化合物，得到影響較大的峰為6（新橙皮苷）、4（柚皮苷）、2（紫花前胡苷）、9（大黃酸）、11（未知，歸屬為羌活）號峰，共5個峰。

圖4 15批三化湯物質(zhì)基準OPLS-DA

3.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學研究

3.4.1 三化湯化合物及靶點預測 三化湯樣品指紋圖譜指認的13個成分在ccTCM、SwissTargetPrediction上搜索和預測相應靶點，去掉重復的靶點，得到499個靶點。

3.4.2 疾病靶點預測 GeneCard 篩選得到5027 個靶點，DrugBank 得到69 個靶點，OMIM 得到95 個靶點，刪除重復項，共得到5058個疾病靶點。

3.4.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 繪制韋恩圖，得到有效成分靶點和疾病靶點數(shù)據(jù)集的交集靶點298 個（圖5）。PPI網(wǎng)絡(luò)模型見圖6。度、介度和緊密度值均大于中位數(shù)且度值＞10 的靶點作為核心靶點，共38個（表2）。

圖5 三化湯治療疾病靶點韋恩圖

圖6 三化湯治療疾病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

表2 三化湯化合物核心靶點

3.4.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

3.4.4.1 GO 功能富集分析 運用DAVID 數(shù)據(jù)庫對已整理的核心靶點進行GO 富集的BP、CC、MF 3個項目進行分析，共得到418 條富集結(jié)果。其中BP 289 條，主要富集基因表達的正調(diào)控、細胞凋亡過程的負調(diào)控、對外源性刺激的反應、肽基絲氨酸磷酸化的正調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控等；CC 39條，主要富集細胞質(zhì)、大分子復合物、核質(zhì)、核等；MF 90 條，主要富集酶結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、激酶活性等過程。根據(jù)P值選取前10條通路展示，見圖7A。

圖7 三化湯治療疾病靶點GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

3.4.4.2 KEGG 通路富集分析 運用DAVID 數(shù)據(jù)庫對已整理的潛在靶點進行KEGG 通路富集，共得到157 條富集通路，其中主要富集到的通路是內(nèi)分泌抵抗、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、前列腺癌、結(jié)直腸癌、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號通路等。根據(jù)P值選取前20 條KEGG 通路展示，見圖7B。

3.4.5 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將指紋圖譜中指認的13 個化合物及其對應靶點、20 條通路及其富集靶點導入Cytoscape，構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，見圖8。結(jié)果表明，大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、和厚樸酚、厚樸酚與靶點及通路的連接強度較大。

圖8 三化湯治療疾病成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

3.4.6 分子對接 由PPI 網(wǎng)絡(luò)可知，三化湯中發(fā)揮療效的主要為腫瘤蛋白P53（TP53）、Akt1、90 kDa熱休克蛋白αA1（HSP90AA1）、非受體酪氨酸激酶（SRC）、磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基α（PIK3CA）等靶點，將13 個成分與核心靶點Akt1 進行分子對接，結(jié)果顯示13 個化合物與Akt1 的結(jié)合能均小于0，表明核心靶點與成分能在體內(nèi)自發(fā)地結(jié)合。分子對接結(jié)合能見表3，分子對接結(jié)果圖見圖9。

圖9 三化湯13個成分與Akt1分子對接結(jié)果

表3 三化湯13個成分與Akt1分子對接結(jié)合能 kcal·mol-1

4 討論

本研究采用HPLC 多波長切換法建立了三化湯的指紋圖譜，共篩選出17個共有峰，并對其中13個峰進行了指認。采用化學計量學分析，15 批三化湯物質(zhì)基準被分為3類，并通過VIP值得出枳實中黃酮類成分及大黃中大黃酸對三化湯的質(zhì)量影響較大。在指認的13 個成分中，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚歸屬于大黃，辛弗林、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷歸屬于枳實，厚樸酚、和厚樸酚歸屬于厚樸，紫花前胡苷、異歐前胡素歸屬于羌活，結(jié)果表明13 個成分滿足Q-marker中處方配伍及特有性的要求；在《中華人民共和國藥典》2020 年版規(guī)定三化湯涉及藥材指標性成分有蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚（大黃的定量指標成分），辛弗林（枳實的定量指標），厚樸酚、和厚樸酚（厚樸的定量指標），異歐前胡素（羌活的定量指標）[15]。13個成分質(zhì)量分數(shù)在三化湯物質(zhì)基準中均較高（＞0.01%），在后續(xù)的三化湯制備工藝研究中，為了探討中藥-飲片-基準物質(zhì)的質(zhì)量傳遞與溯源，根據(jù)三化湯指紋圖譜的色譜條件，建立了同時測定13 個成分含量的測定方法，方法學驗證結(jié)果表明符合指導原則要求，表明13 個成分均滿足Q-marker中可測性的原則。

卒中后便秘可能是因為卒中后人的活動能力受限、活動減少，胃腸運動也受到影響，容易導致便秘。吳門醫(yī)派認為卒中責之肝腎陰虛，水不涵木，卒中之后易向胃陰不足轉(zhuǎn)歸而發(fā)生便秘[16]。三化湯中大黃的功能主治為瀉下攻積、清熱瀉火，用于實熱積滯便秘，其中蒽醌類成分蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚是大黃的主要活性物質(zhì)[17]。唐大軒等[18]研究得出大黃中發(fā)揮導瀉作用的最終物質(zhì)是蒽醌類成分，其刺激胃腸道分泌，升高胃腸道內(nèi)蛋白質(zhì)濃度，進而發(fā)生容積性導瀉。枳實中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷可促進胃腸動力，有顯著促進胃腸蠕動和胃排空的作用，抑制腸道內(nèi)炎癥因子和蛋白質(zhì)的過度表達，減少對腸黏膜的損傷[19]，改善便秘；辛弗林有松弛胃平滑肌的作用[20]。厚樸中厚樸酚與和厚樸酚均有促進小鼠胃排空和腸推進的作用，和厚樸酚具有抗炎作用[21-23]，在腦缺血的治療中有良好效果[24]。羌活中紫花前胡苷、異歐前胡素具有抗炎鎮(zhèn)痛作用[25]。結(jié)果提示三化湯中大黃蒽醌類成分、枳實黃酮類成分及生物堿成分、厚樸中厚樸酚與和厚樸酚、羌活中紫花前胡苷和異歐前胡素有改善胃腸道環(huán)境、促進胃腸道蠕動、抗炎、治療腦缺血的作用。

對13 個成分進行網(wǎng)絡(luò)藥理學預測分析，得出TP53、Akt1、HSP90AA1、SRC、PIK3CA 等為三化湯核心靶點。研究發(fā)現(xiàn)，激活Akt1可以維持Cajal間質(zhì)細胞（ICC）的功能，ICC 胃腸道運動有緊密關(guān)系[26-27]。TP53 和HSP90AA1 是癌癥相關(guān)靶點。研究表明，便秘會增加短期內(nèi)患癌癥的風險[28]；Zhang等[29]證實，HSP90AA1 通過正向調(diào)節(jié)SRP9，使結(jié)直腸癌細胞過度增殖。SRC 家族包括膜結(jié)合型非受體酪氨酸激酶亞類，其參與各種細胞信號傳導途徑。研究表明，SRC 磷酸化可增加微血管通透性，并參與血腦屏障損傷后的病理通透過程，抑制SRC 活性可有效保護血腦屏障，減輕腦腫脹[30]。PIK3CA 是PI3K 的催化亞基，參與多種生長因子的細胞信號傳導[31]。結(jié)果提示，TP53、Akt1、HSP90AA1、SRC、PIK3CA 可能與三化湯治療卒中后二便不通、腦缺血有關(guān)。

KEEG 通路主要涉及了癌癥通路、內(nèi)分泌抵抗、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、PI3K-Akt 信號通路等。分子對接對網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)果進行了驗證結(jié)果顯示，13 個成分均能與核心靶點穩(wěn)定地結(jié)合。便秘可能涉及PI3K/Akt 信號通路，Yao 等[32]認為可以通過上調(diào)Akt的磷酸化、增強PI3K/Akt 和核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2/血紅素氧合酶1（Nrf2/HO-1）信號通路，減少免疫細胞凋亡，進而改善便秘。PI3K/Akt 信號通路被激活后可調(diào)控抗神經(jīng)元凋亡以及促進血管新生保護腦組織[33]。Yan等[34]證實，激活PI3K/Akt/mTOR通路可抑制氧化應激相關(guān)的神經(jīng)元自噬，發(fā)揮神經(jīng)保護功能。腦缺血有可能引起嚴重的炎癥反應、腦水腫和神經(jīng)功能缺損[35-36]。結(jié)果提示三化湯可能是通過TP53、Akt1、HSP90AA1、SRC、PIK3CA 等靶點作用于PI3K/Akt信號通路發(fā)揮療效。

綜上所述，三化湯中13 個成分均滿足Q-marker五原則，基于VIP 值＞1（新橙皮苷、柚皮苷、紫花前胡苷、大黃酸）、成分含量排名前4（柚皮苷、新橙皮苷、辛弗林、紫花前胡苷）及成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)中連接強度前5（大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、和厚樸酚、厚樸酚），預測新橙皮苷、柚皮苷、紫花前胡苷、大黃酸、辛弗林、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、和厚樸酚、厚樸酚10 個成分可能為三化湯的潛在Q-marker，為三化湯質(zhì)量控制及后續(xù)研究提供了參考。

本研究只進行了三化湯指紋圖譜與網(wǎng)絡(luò)藥理學的研究，網(wǎng)絡(luò)藥理學的研究存在一定的局限性，后續(xù)可以開展三化湯治療卒中、腦缺血、卒中后二便不通的動物、細胞實驗，進一步深入研究三化湯作用機制。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。