龍眼肉調節腸道菌群和BDNF-TrkB通路抗AD的作用機制研究△

李紅艷，雷天榮，岳德瓊，趙晨陽，張晗，李昶，楊靜嫻

1.遼寧中醫藥大學，遼寧 大連 116600；

2.河北平安健康集團股份有限公司，河北 石家莊 050000

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種以記憶和認知功能障礙為主要臨床表現的神經退行性疾病，目前尚無理想治療策略。運用中醫藥多靶點和整體調節優勢對AD 進行早期預防與治療至關重要[1]。龍眼肉是無患子科植物龍眼Dimocarpus longanLour.的假種皮，有補益心脾、養血安神功能[2]。據報道，龍眼肉能提高AD 小鼠的學習記憶能力[3]；本課題組前期研究表明，龍眼肉能抑制脾虛癡呆小鼠的病理進程[4]。由于脾虛與腸道菌群失調互為因果[5]，筆者推測腸道菌群可能是龍眼肉抗AD 的作用靶點。基于前期基礎和文獻分析，本研究擬通過AD 小鼠模型聯合16S-rDNA 測序探討龍眼肉抗AD的作用與腸道菌群的相關性，并通過檢測腦源性神經營養因子（BDNF）-酪氨酸激酶受體B（TrkB）通路關鍵蛋白表達，探究龍眼肉抗AD的分子機制。

1 材料

1.1 實驗動物

無特定病原體（SPF）級KM 小鼠30 只，體質量18～22 g，雌性，購于遼寧長生生物科技有限公司，實驗動物質量認證許可證號：SCXK（遼）2020-0001，合格證證號：210726221101473418，動物實驗經遼寧中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準文號：21000042021133）。

1.2 樣品

龍眼肉購于安徽益生源中藥飲片科技有限公司，經遼寧中醫藥大學王添敏教授鑒定為無患子科植物龍眼Dimocarpus longanLour.的假種皮。

1.3 試藥

DNA 抽提試劑盒（批號：12888-100，Qiagen公司）；抗淀粉樣前體蛋白（APP）抗體（批號：A16265）、抗BDNF抗體（批號：A11028）、抗TrkB抗體（批號：A12325）、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（批號：3561122204）、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔二抗（批號：AS014）均購于ABclonal 公司；抗磷酸化Tau（p-Tau，Ser396）抗體（批號：AF3148）、抗磷酸化TrkB（p-TrkB，Tyr515）抗體（批號：AF3462）均購于Affinity 公司；蛋白裂解液（批號：B0B800150）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量測定試劑盒（批號：B27A001200）均購于沈陽鼎國生物科技有限公司；電化學發光（ECL）試劑盒（批號：P0018AFT，碧云天生物技術有限公司）。

1.4 儀器

NanoDrop2000 型微量紫外-可見分光光度計、Qubit 型熒光計均購于Thermo Fisher 公司；Miseq 型測序儀、Mi Seq 測序平臺均購于Illumina 公司；580BR10905型聚合酶鏈式反應（PCR）儀（Bio-Rad公司）；2500型凝膠成像儀（Tanon公司）。

2 方法

2.1 龍眼肉水提取物的制備

參照本課題組前期方法[4]制備龍眼肉水提取物，取龍眼肉200.00 g，加10倍量雙蒸水浸泡1 h后，加熱使沸騰，保持沸騰狀態繼續煎煮1 h，濾過并收集濾液，提取3次，合并濾液，60 ℃減壓濃縮至200 mL，冷凍干燥，-20 ℃保存。重復3次實驗，計算提取率。

2.2 動物分組及給藥

SPF級KM小鼠，隨機分為對照組、模型組和龍眼肉組，每組10只。除對照組外，其余各組皮下注射D-半乳糖（140 mg·kg-1）及灌胃AlCl3（20 mg·kg-1），給藥體積均為10 mL·kg-1，誘導建立小鼠AD模型[6]，每日1次，連續60 d；造模同時，龍眼肉組灌胃給予龍眼肉水提取物2.0 g·kg-1（生藥量）[4]，給藥體積10 mL·kg-1；對照組給予等量0.9%氯化鈉溶液。

2.3 Morris水迷宮檢測小鼠學習記憶能力

AD 造模55～60 d，進行Morris 水迷宮檢測，實驗共6 d，前5 d為定位航行實驗，每天于4 個象限各訓練1 次，每次60 s，以第5 天成績作為定位航行實驗結果；第6 天撤去水下平臺，進行空間探索實驗，以離平臺最遠象限作入水點。

2.4 16S-rDNA測序及生物信息學分析

Morris 水迷宮實驗結束后，無菌收集各組小鼠糞便，每組收集1.0 g 左右，密封于無菌EP 管中，采用DNA 抽提試劑盒提取樣本DNA，瓊脂糖凝膠電泳及微量紫外-可見分光光度計檢測DNA 純度和濃度，以基因組DNA為模板，用帶barcode 的特異引物進行PCR 擴增。委托上海歐易生物醫學科技有限公司，對對照組、AD 模型組及龍眼肉組3 個組別共18 個樣本進行16S-rDNA 測序。多樣性鑒定區域為v3v4 區，引物序列為343F（5'-TACGGRAGGCAG CAG-3'）和798R（5'-AGGGTATCTAATCCT-3'）。擴增產物經電泳檢測及磁珠純化后再次PCR擴增，反復2 次，純化后的PCR 產物進行Qubit 定量，根據PCR產物濃度進行等量混樣，并上機測序，根據序列相似性，將相似度≥97%歸為一個可操作單元（OTU），使用Qiime 1.8.0軟件包挑選出各OTU的代表序列，并將所有代表序列與Silva 數據庫進行比對注釋，利用歐易生物云平臺R包軟件進行相關分析及繪圖。

2.5 Western blot檢測相關蛋白表達

各組取4 只小鼠海馬組織，置于RIPA 裂解液中研磨，3000 r·min-1、4 ℃離心10 min（離心半徑為14 cm），BCA 試劑盒測定蛋白濃度。等量的蛋白樣品用8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離、轉膜，加一抗（抗APP、p-Tau、BDNF、TrkB 及p-TrkB 抗體，1∶1000 稀釋）4 ℃孵育過夜，酶標二抗（1∶4000 稀釋）室溫孵育1 h，ECL顯色，化學發光成像系統成像，Image J 1.53軟件分析條帶光密度值。

2.6 數據統計分析

采用GraphPad Prism 8.0.2統計軟件進行數據分析，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗，數據采用（±s）表示；16S 高維度數據，組間比較采用R語言相似性分析（Anosim）和多元方差分析（Adonis）；P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 龍眼肉水提取物的提取率及成分

龍眼肉水煎液冷凍干燥后稱質量，計算提取率為49.27%±3.98%。根據前期研究結果，龍眼肉水提取物含有糖類、氨基酸、核苷酸等多種成分，糖類中以葡萄糖質量分數最高，為246.18 g·kg-1，占龍眼肉水提取物總質量的24.62%；并含有甘露糖等單糖成分、L-脯氨酸等氨基酸成分和尿苷等核苷酸成分[4]。

3.2 龍眼肉提高了AD小鼠學習記憶能力

Morris 水迷宮定位航行實驗（圖1A～圖1C）中小鼠逃避潛伏期（第一次上臺時間）和第一次上臺前路程，模型組均較對照組延長（P＜0.001），龍眼肉組較模型組縮短（P＜0.001，P＜0.01）；各組小鼠第一次上臺前平均速度，模型組較對照組慢但差異無統計學意義，龍眼肉組較模型組加快（P＜0.05）。空間探索實驗（圖1D～圖1F）中小鼠穿越原平臺次數、在原平臺總停留時間和平臺停留時間百分比，模型組均較對照組減少（P＜0.001），龍眼肉組均較模型組增加（P＜0.001）；另外，上述各檢測結果，龍眼肉組與對照組差異均無統計學意義（圖1）。結果表明，該造模條件下，模型小鼠出現了典型的學習記憶功能障礙，龍眼肉能提高小鼠學習記憶能力，并使之恢復至正常水平。

圖1 龍眼肉對AD小鼠學習記憶能力的影響（±s,n=10）

3.3 龍眼肉改變了AD小鼠菌群多樣性

3.3.1 OTUs分類分析 通過OTUs分類對不同來源的微生物群落樣本進行分析，繪制花瓣圖（圖2A），結果可見，除去3組共有OUTs數191，模型組OUTs平均數目1711，較對照組（2139）明顯減少（P＜0.01）；龍眼肉組OUTs 平均數目（1840）較模型組增加，但差異無統計學意義。對各分類層級（界、門、綱、目、科、屬、種）上各樣本的OTUs 數目和注釋結果進行統計，結果表明，各組樣本在不同分類水平下注釋OTUs的總tags數目不同（圖2B）。

圖2 龍眼肉對AD小鼠OTUs分類水平的影響（±s,n=6）

3.3.2α多樣性和β多樣性分析α多樣性分析反映生物環境內物種的多樣性程度，常用物種累積曲線和等級聚類曲線等表示。由圖3A可見，隨著樣本量增加，物種累積曲線趨于平緩，表明抽樣充分；由圖3B 可見，等級聚類曲線寬而平坦，說明物種組成豐富且均勻度良好。β多樣性反應生境間的多樣性程度，使用R軟件繪制PCoA分析圖，觀察個體或群體間的差異，依據Bray Curtis 算法分析物種有無并進行Anosim 分析，結果表明，3 組間物種差異有統計學意義（圖3C，P＜0.01），進一步基于Euclidean歐氏距離算法比較組間物種豐度差異，采用Adonis進行組間兩兩比較分析，發現組間物種豐度差異均有統計學意義（圖3D～圖3F，P＜0.01）。

3.3.3 菌群群落結構分析 以屬水平為例，對群落結構做進一步分析，制作豐度前15（TOP15）菌群結構柱狀圖（圖4A），選取差異物種豐度TOP10進行方差分析，制作相對豐度柱形圖（圖4B～圖4K）。結果表明，與對照組比較，模型組擬普雷沃菌屬、瘤胃球菌科_UCG-014 屬、普雷沃氏菌科UCG-001、理研菌科RC9_gut屬、瘤胃梭菌屬和瘤胃球菌屬_1豐度顯著升高（P＜0.05），馬文布賴恩特菌屬豐度顯著降低（P＜0.001）；經龍眼肉處理后，上述各種異常升高的菌屬豐度均顯著降低（P＜0.05），但對馬文布賴恩特菌屬，龍眼肉則無明顯影響。另外，鼠桿菌屬和毛螺菌科_UCG-001屬，模型組與對照組差異無統計學意義，龍眼肉則使兩者豐度顯著提高（P＜0.01）。

圖4 龍眼肉對AD小鼠群落結構的影響（±s,n=6）

3.4 龍眼肉影響了小鼠海馬組織相關蛋白表達

與對照組相比，模型組APP 和p-Tau 蛋白表達顯著提高（P＜0.05），龍眼肉2.0 g·kg-1（生藥量）能顯著降低模型組小鼠海馬組織APP 及p-Tau 蛋白表達（P＜0.05）。模型組與對照組比較，BDNF、TrkB、p-TrkB蛋白及p-TrkB/TrkB蛋白表達均顯著降低（P＜0.05），龍眼肉2.0 g·kg-1（生藥量）提高了海馬組織上述蛋白表達，其中對BDNF、p-TrkB 和p-TrkB/TrkB 蛋白表達影響差異有統計學意義（P＜0.05），對TrkB蛋白表達的影響無統計學意義（圖5）。

圖5 龍眼肉對AD小鼠海馬組織相關蛋白表達的影響（±s,n=3）

4 討論

APP 是一種廣泛存在于多種組織的跨膜蛋白，可分解產生β淀粉樣蛋白（Aβ）。大腦皮層及海馬區出現Aβ沉積和Tau 蛋白過度磷酸化是AD 的典型病理特征。根據記憶力減退、Aβ沉積和Tau 過度磷酸化是AD 的典型特征，本研究首先采用Morris 水迷宮實驗和蛋白免疫印跡實驗對實驗模型進行驗證，并分析龍眼肉對類AD 小鼠的治療作用，結果表明，實驗成功建立了類AD 小鼠模型，并且該模型的病理特征可被龍眼肉逆轉。進一步，筆者利用16SrDNA 測序技術進行小鼠糞便微生物多樣性分析，結果提示龍眼肉可能通過調節菌群平衡干預AD。本研究D-半乳糖/AlCl3誘導的AD 小鼠模型瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）_UCG-014 豐度升高與AD 患者菌群變化一致[7]；龍眼肉組瘤胃球菌屬（Ruminococcus）_1 及毛螺菌科（Lachnospiraceae）_UCG-001 屬豐度升高亦與文獻APP/PS1 小鼠治療后腸道微生物變化結果相符[7]。瘤胃球菌科、瘤胃球菌屬和毛螺菌科_UCG-001均歸屬厚壁菌門，厚壁菌門是體內丁酸的主要生產者[8]。本研究結果提示龍眼肉可能是通過影響厚壁菌門，改變其代謝產物短鏈脂肪酸水平進而產生中樞作用。

BDNF 是在腦內合成的一種神經營養因子，在神經元的存活、分化及生長發育中起著重要作用，影響情感和認知功能[9]。在AD 發生早期，AD 患者就已經檢測出腦組織中BDNF 表達下降[10]。TrkB 是BDNF 的特異性受體，BDNF 與TrkB 結合后，引起TrkB 自身磷酸化增加，進而促進神經元生長、生存和分化[11]。腸道菌群與AD等中樞神經退行性疾病相關，與腦-腸軸相互作用、相互影響[12]。據報道，腸道菌群紊亂會減少大腦皮質及海馬中的BDNF表達，從而導致中樞神經系統功能失調，引起行為異常和認知障礙乃至AD的發生[13]?；谀c道菌群與脾的異曲同工作用，以及其與BDNF 的密切相關性，本研究在龍眼肉抑制小鼠脾虛癡呆[4]的前期研究基礎上，探討了龍眼肉調節腸道菌群和BDNF-TrkB 通路抗AD 的作用機制。Western blot 實驗結果表明，龍眼肉顯著提高了BDNF-TrkB 通路關鍵蛋白BDNF 和p-TrkB 蛋白表達，提高了p-TrkB/TrkB 蛋白表達的比值。綜合本研究結果，筆者認為龍眼肉能夠明顯抑制D-半乳糖/AlC3誘導的類AD 小鼠病理進程，調節腸道菌群、激活BDNF-TrkB 信號通路是龍眼肉抗AD的可能機制。

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