香葉木素調控Hedgehog信號通路對骨質疏松性骨缺損的影響

蔡丹宇 王攀峰 周文彬

1.蘇州市中西醫結合醫院骨科,江蘇 蘇州 215000

2.上海長海醫院創傷骨科,上海 200433

3.蘇州市中西醫結合醫院骨二科,江蘇 蘇州 215000

骨質疏松(osteoporosis,OP)是一種伴隨骨量減少、骨密度(bone mineral density,BMD)和骨微結構破壞的代謝性骨病,多發于絕經后婦女及中老年人群[1]。OP具有較高的發病率及死亡率,患者易出現骨缺損,但目前能夠有效治療骨質疏松性骨缺損的藥物較少,因此尋找有效治療骨質疏松性骨缺損的藥物十分必要[2-3]。來自于柑橘類水果的香葉木素是一種天然黃酮類化合物,具有抗炎、抗菌等多種藥理活性,近年來有研究發現,香葉木素能有效促進人成骨細胞分化及成熟,而且能夠抑制OP大鼠破骨細胞生成及骨丟失[4]。骨愈合過程受多種信號通路調控,Hedgehog信號通路在骨形成中具有關鍵作用,其激活有助于骨骼發育及骨穩態[5-6]。Hedgehog信號通路在OP小鼠成骨細胞中被顯著抑制,其激活能有效抑制成骨細胞凋亡,促進細胞活力及鈣結節增加[7]。但目前關于香葉木素是否可通過調節Hedgehog通路來影響骨質疏松性骨缺損還鮮有報道,因此,本研究旨在探究香葉木素調控Hedgehog信號通路對骨質疏松性骨缺損愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

將從三峽大學購買的SPF級SD大鼠(222～255 g,50 只)于相對濕度55%,12 h明暗交替的動物房飼養一周,許可證:SCXK(鄂)2017-0012,實驗前禁食12 h。本研究已經通過蘇州市中西醫結合醫院動物倫理委員會審核批準(批號:2021-005192)。

1.2 主要試劑

香葉木素【貨號:HP00034A,海蔻希(杭州)生命科學研究有限公司】;環杷明(貨號:dasf-5153,南京道斯夫生物科技有限公司);蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒(貨號:YX-DK00686,浙江羽翔生物科技有限公司);蛋白提取試劑盒、反轉錄試劑盒(貨號:EX6120-50 T、RE0510-100 T,定州百克賽斯生物科技有限公司);二喹啉甲酸蛋白檢測(Bicinchoninic Acid Assay,BCA)蛋白檢測試劑盒(貨號:CS-R99145,上海莼試生物技術有限公司);實時定量PCR(quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR)試劑盒(貨號:CD-13506-ML,武漢純度生物科技有限公司)。兔抗音猬因子(Sonic hedgehog,Shh)、β-actin、跨膜蛋白受體1(Ptched 1,Ptch 1)、Gli家族鋅指蛋白-1(Gli family zinc finger-1,GLI1)、標記的山羊抗兔IgG二抗抗體(貨號:2207、4970、2468、2534、5348,Cell Signaling Technology);兔抗成骨細胞特異性轉錄因子(Osterix)、Runt相關轉錄因子2(Runt Related Transcription Factor 2,Runx2)抗體(貨號:ab22552、ab23981,Abcam);Azure Biosystems C150凝膠成像系統、普邁小動物雙能X射線骨密度儀、普邁ASA-4800實時熒光定量PCR儀購自普邁精醫科技(北京)有限公司。

1.3 分組與模型構建

將50只SD大鼠(按10 只/組)分為假手術組、模型組、低劑量組(50 mg/kg香葉木素)、高劑量組(100 mg/kg香葉木素)[4]及高劑量+環杷明組(100 mg/kg香葉木素+10 mg/kg Hedgehog信號通路特異性抑制劑環杷明)[8]。骨質疏松性骨缺損模型構建:使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,于無菌環境中切開皮膚,分離并結扎輸卵管及其周圍血管,摘除卵巢,構建OP大鼠模型,縫合后肌肉注射青霉素2.5×104U/d用于預防感染;術后8周進行X射線觀察造模情況,見圖1。以此模型為基礎進行骨缺損模型構建,水合氯醛(10%)腹腔注射麻醉大鼠,暴露其近膝關節處肌肉組織,鈍性分離后暴露股骨干骺端,使用慢速直流電鉆由外向內鉆一貫通性骨缺損區域(直徑約為2 mm),縫合后再次注射青霉素2.5×104U/d用于預防感染,假手術組僅切除卵巢旁部分脂肪[3];造模結束后,低劑量組、高劑量組及高劑量+環杷明組灌胃對應劑量香葉木素及環杷明,而模型組、假手術組以等體積生理鹽水灌胃,灌胃時間為期6周,1次/d。

圖1 去卵巢骨質疏松模型造模前后X線對比Fig.1 Comparison of X-rays before and after the establishment of ovariectomized osteoporosis model

1.4 大鼠骨痂部位BMD檢測

給藥結束后,使用水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,雙能X線吸收掃描儀以骨骼結痂為中心區域進行掃測,分析大鼠骨痂BMD值(n=10)。

1.5 HE染色觀察大鼠骨缺損區域病理學情況

取5只大鼠骨缺損處上下0.5 cm區域骨組織,浸泡于多聚甲醛(10%)固定,EDTA-Na緩沖液脫鈣處理,制作石蠟切片(4 μm),一部分經脫蠟、水化、蘇木精-伊紅染色、乙醇脫水、中性樹脂封片、觀察(n=5),并進行Lane-Sandhu組織學評分[9];另一部分用于抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色。

1.6 TRAP染色觀察大鼠骨缺損區域破骨細胞情況

取石蠟切片進行TRAP染色(37 ℃、1 h),經蘇木素復染后使用自來水反藍,于光鏡下觀察染色情況(400×),紫紅色區域即為破骨細胞陽性染色(n=5)。

1.7 qRT-PCR檢測大鼠骨缺損區域組織Osterix和Runx2表達

取其余5只大鼠骨缺損區域組織,于液氮中研磨至粉末狀,一部分使用Trizol提取組織總RNA,將其反轉錄成cDNA,以其為模板進行qRT-PCR,GAPDH為內參(n=5),通過2-ΔΔCt計算Osterix和Runx2表達,引物見表1;另一部分用于蛋白免疫印跡實驗(Western blot)。

表1 qRT-PCR引物Table 1 qRT PCR primers

1.8 Western blot檢測骨缺損區域組織SHH、GLI1、Ptch1、Osterix和Runx2表達水平

使用裂解液裂解組織提取總蛋白,經電泳、低溫轉膜、牛血清白蛋白封閉后,添加兔抗SHH、GLI1、Ptch1、Osterix、Runx2、β-actin一抗,孵育過夜并進行PBS清洗,加入二抗(HRP標記的山羊抗兔IgG)孵育,滴加1 mL發光試劑顯色,通過蛋白凝膠成像儀觀察并拍照,測定灰度值并分析各蛋白相對表達水平(n=5)。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 香葉木素對大鼠骨痂部位BMD的影響

模型組BMD較假手術組顯著降低(P<0.05);與模型組比較,低劑量組、高劑量組骨痂部位BMD依次顯著增加(P<0.05);與高劑量組比較,高劑量+環杷明組骨痂部位BMD顯著降低(P<0.05),見表2、圖2。

表2 香葉木素對大鼠骨痂部位BMD的影響

圖2 各組大鼠X射線比較Fig.2 Comparison of X-ray images among rat groups

2.2 香葉木素對大鼠骨缺損區域病理學的影響

假手術組大鼠股骨存在大量骨小梁緊密、規則排列,相互交織成網狀結構;模型組骨缺損區域骨小梁大量斷裂、數量減少、稀疏排列、骨髓腔明顯增大,且Lane-Sandhu組織學評分較假手術組顯著降低(P<0.05);與模型組比,低劑量組、高劑量組骨缺損區域骨小梁數量明顯增加,排列較為緊密、骨髓腔明顯減小,Lane-Sandhu組織學評分依次顯著增加(P<0.05);與高劑量組比,高劑量+環杷明組骨小梁數量減少,出現斷裂,骨髓腔增大,且Lane-Sandhu組織學評分顯著降低(P<0.05),見圖3、表3。

表3 各組大鼠Lane-Sandhu組織學評分

圖3 香葉木素對大鼠骨缺損區域病理學的影響(HE,比例尺:200 μm)Fig.3 Effect of diosmetin on the pathology of bone defect areas in rats (HE, Scale: 200 μm)

2.3 香葉木素對大鼠骨缺損區域破骨細胞的影響

模型組TRAP陽性細胞數較假手術組顯著增加(P<0.05);與模型組比較,低劑量組、高劑量組TRAP陽性細胞數依次顯著降低(P<0.05);與高劑量組比較,高劑量+環杷明組TRAP陽性細胞數顯著增加(P<0.05),見圖4、表4。

表4 各組大鼠TRAP陽性細胞數個/mm2)

圖4 香葉木素對大鼠骨缺損區域破骨細胞的影響(TRAP染色,比例尺:50 μm)Fig.4 Effect of diosmetin on osteoclasts in bone defect areas of rats (TRAP staining, Scale: 50 μm)

2.4 香葉木素對大鼠骨缺損區域組織Runx2、Osterix表達的影響

模型組骨缺損區域組織Osterix和Runx2 mRNA表達較假手術組顯著降低(P<0.05);與模型組比較,低劑量組、高劑量組Osterix和Runx2 mRNA表達依次顯著增加(P<0.05);與高劑量組比較,高劑量+環杷明組Osterix和Runx2 mRNA表達顯著降低(P<0.05),見表5。

表5 香葉木素對大鼠骨缺損區域組織Osterix和Runx2表達的影響

2.5 香葉木素對大鼠骨缺損區域組織SHH、GLI1、Ptch1表達的影響

模型組骨缺損區域組織SHH、GLI1、Ptch1、Osterix和Runx2表達較假手術組顯著降低(P<0.05);與模型組比較,低劑量組、高劑量組SHH、GLI1、Ptch1、Osterix和Runx2表達依次顯著增加(P<0.05);與高劑量組比較,高劑量+環杷明組SHH、GLI1、Ptch1、Osterix和Runx2表達顯著降低(P<0.05),見表6、圖5。

表6 香葉木素對大鼠骨缺損區域組織SHH、GLI1、Ptch1表達的影響Table 6 Effect of diosmetin on the expressions of SHH, GLI1, and Ptch1 in the tissue of rat bone

圖5 香葉木素對大鼠骨缺損區域組織SHH、GLI1、Ptch1表達的影響Fig.5 Effect of diosmetin on the expressions of SHH, GLI1, and Ptch1 in the tissue of rat bone defects

3 討論

OP主要由破骨細胞分化增加及成骨細胞分化減弱造成,OP患者常伴隨有病理性骨缺損發生,但由于OP患者破骨細胞活性高于成骨細胞,因此其自身修復能力不佳,常需要臨床藥物干預,但目前用于治療骨質疏松性骨缺損的藥物十分有限,因此,尋找新的治療藥物對OP患者骨缺損愈合極其重要[10-13]。

黃酮類化合物已被證明具有誘導成骨細胞分化等多種生物學功能,香葉木素作為一種天然黃酮類化合物能夠有效抑制破骨細胞活性,促進成骨細胞分化,其可能是治療OP的潛在藥物[4]。香葉木素能夠刺激股骨截骨術大鼠骨痂再生,增加股骨強度,促進骨形成,抑制去卵巢骨質疏松大鼠骨吸收[14]。香葉木素可通過抑制瞬時受體電位通道香草醛亞型-1表達緩解骨質疏松大鼠骨組織病理學損傷及骨質流失[4]。Runx2表達于成骨細胞中,是成骨細胞分化及骨形成所必需的關鍵轉錄因子,Osterix是成骨細胞特異性轉錄因子[9,15]。TRAP則是破骨細胞分化和形成的標志基因,其增加可增強破骨細胞活性[16]。本研究發現,香葉木素能夠顯著增加OP大鼠骨痂部位BMD、骨小梁數、Osterix、Runx2表達,降低TRAP陽性細胞數,該結果表明香葉木素能夠通過促進Osterix、Runx2表達,抑制TRAP表達來促進骨缺損區域成骨細胞分化及骨形成,抑制破骨細胞活性,其有成為骨質疏松性骨缺損治療藥物的可能。

Hedgehog蛋白作為一個高度保守的分泌糖蛋白家族,在成骨細胞分化及胚胎發育進程軟骨內骨形成中具有重要作用,參與維持骨穩態,在骨折愈合過程中被顯著激活[6,17]。SHH是Hedgehog通路同源蛋白之一,GLI1作為SHH的下游因子,與其共同參與骨折愈合區的成骨細胞分化,而Ptch作為該通路的跨膜激活蛋白,是激活該通路所必須的膜上受體[6,18]。Hedgehog信號通路可通過抑制c-Jun氨基末端激酶/c-Fos-活化T-細胞核因子1級聯反應來抑制破骨細胞分化及活性[19]。miR-152可通過激活OP大鼠骨組織Hedgehog信號通路來增加骨生物力學強度及促進骨重建[20]。金烏健骨膠囊可通過激活Shh信號通路促進成骨相關因子Osterix、Runx2表達,從而促進成骨[21]。本研究發現,OP大鼠骨缺損區域組織SHH、GLI1、Ptch1表達顯著減少,而香葉木素則可促進OP大鼠骨缺損區域組織SHH、GLI1、Ptch1表達,該結果表明,OP大鼠Hedgehog信號通路受到抑制,而香葉木素能夠有效激活OP大鼠Hedgehog信號通路。環杷明可抑制骨髓間充質干細胞成骨分化標志物的表達,辛伐他汀可通過激活Hedgehog信號通路刺激骨髓間充質干細胞成骨分化,而環杷明作為Hedgehog通路抑制劑則能夠逆轉該過程[22]。而本研究發現,環杷明可逆轉香葉木素對OP大鼠骨缺損區域成骨細胞分化及骨形成的促進以及破骨細胞活性的抑制,從而抑制骨缺損愈合,該結果表明,香葉木素對OP大鼠骨缺損愈合的促進作用可能與其激活Hedgehog通路有關。

綜上所述,香葉木素對骨質疏松性骨缺損愈合的促進作用可能與激活Hedgehog通路有關,本研究不僅為骨質疏松性骨缺損治療藥物的尋找提供線索,還為其治療機制的研究提供幫助。但由于實驗模型樣本量的限制,未對其下游機制進行探究,因此,在以后的研究中會繼續加大樣本量以完善研究。