實驗小鼠肝炎病毒研究進展及其檢測與防治措施

陳姝彤，王馨，張若文

（北華大學基礎醫學院 吉林吉林 132000）

1 MHV 的研究進展

1.1 MHV 的病毒特性

在分類上小鼠肝炎病毒（MHV）屬冠狀病毒科中的冠狀病毒屬。根據MHV 特性的不同，可將MHV 分為兩類：腸毒株和呼吸毒株。腸毒株有MHV-Y、MHV-S、MHV-U 等分型，呼吸毒株又有MHV-1、MHV-2、MHV-A59 等分型[1]，所以感染MHV 后小鼠會有腸炎和肝炎的臨床表現。傳染源頭一般是帶毒小鼠的糞便和墊料，MHV 可通過胎盤垂直傳播，這導致不帶母源抗體的乳鼠感染易發病和死亡[2]。

MHV 是單股正鏈RNA，且為線性不分段。它的病毒粒子呈多形態或圓形，它的直徑一般為80～160 nm[3]。MHC 的核蛋白主要由3 個蛋白結構組成：M 蛋白、S 蛋白和E 蛋白。M 蛋白是其中比較保守的抗原決定蛋白；而S 蛋白主要功能是介導病毒進入宿主細胞，可以識別細胞表面的MHV 病毒受體，近而參與MHV 感染的過程；E 蛋白則是在病毒組裝和脫殼過程中發揮催化活性的關鍵性蛋白。而核蛋白又與RNA 結合之后構成了位于病毒中心的核蛋白殼，其結構呈螺旋狀，最后病毒包膜包繞在其上，從而形成病毒粒子[4-5]。

1.2 MHV 的研究進展

通常情況下，pH 值是不會影響病毒蛋白介導的膜融合過程的。但是早期有研究表明，堿性的小腸內MHV 的感染會引起腸上皮細胞融合[6]。所以，MHV 誘導融合的最佳pH 值或許是中性或者堿性。這表明pH 值對MHV 存在著一定的影響，而膜融合蛋白對pH 值依賴的構象變化或許對病毒誘導的細胞膜融合也發揮著相應作用。但是，pH 值對受體依賴的MHV 感染小鼠細胞有著怎樣的作用在研究領域還存在一定的爭議，這也引起了學者的探討。目前有研究表明，不依賴pH 值改變，MHV-A59 也可以進入細胞，但是有研究者發現應用溶酶體抑制劑后MHV-A59 的感染程度或許降低。因此，低pH 值有利于MHV-A59 的感染。S 蛋白轉染細胞后出現膜融合現象，當pH 值升高，細胞膜融合受構象變化所誘導會逐漸變得更加明顯[7-9]。進一步研究表明MHV 的S 蛋白在高pH 值，無受體存在的情況下發生的構象改變和受體依賴的S 蛋白產生的構象改變是很接近的[10]，這也與S 蛋白隨著pH 升高發生的構象改變非常接近，所以，pH 值和S 蛋白誘導的膜融合之間的存在的具體關聯還需繼續研究證明。

2 MHV 的診斷技術

有研究人員發現，給小鼠人工感染MHV 后2 d 內就可以在小鼠肺臟中檢測出陽性病毒，隨后在其他組織的樣本中也可以檢測出陽性病毒，病毒陽性率在14 d 后開始降低，所有組織的樣本在84 天后的病毒檢測結果都是陰性[11]。而抗體則不同，在此小鼠體內的抗體產生周期短，存留時間相對很長，IgG 在5～7 d 內明顯升高，標本檢測陽性率明顯上升，3 周就達到高峰，并且抗體檢測陽性可以維持在28 d，之后才開始緩慢下降；而IgM 水平上升的時間更早，3 d 的陽性檢測率就開始升高，7 d 則達到高峰，各個標本陽性檢測率均良好，3 周之后陽性檢測率開始下降[12]。這可以表明，抗原可以作為早期檢測而提供幫助，抗體檢測具有高穩定性，適用于MHV 的日常監測，同時IgM 也可以考慮用于早期感染的檢測指標。

目前，對判斷MHV 感染的方法有很多，《實驗動物：小鼠肝炎病毒檢測方法》中規定的常規檢測方法有酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、間接免疫熒光抗體試驗（IFA）和免疫酶試驗（IEA）。

2.1 血清學檢測方法

由于IEA 存在抗原不易制備的情況，而ELISA 和IFA 均有商品化的常規檢測試劑盒，所以，對于常規樣本的MHV 檢測方法，目前我國的檢測機構通常應用ELISA 方法進行初篩試驗，而對于陽性的樣本再用IFA 方法進行復檢[13]。用ELISA 法檢測MHV 具有高度的特異性、操作方法簡便和用時短等優點。但是不同的MHV 之間的抗原性存在不同，在日常的操作過程中，多采用多價抗原進行檢測。有研究實驗利用了兩種不同的MHV 組合的抗原包被酶標板，從而構建了應用間接ELISA 方法進行的MHV 抗體檢測，實驗表明這種方法可以檢測出更多的陽性標本[14]。但是ELISA 的檢測結果需要通過肉眼進行觀察顏色來判定，這種方式存在著一定的主觀意識，所以ELISA 法經常用于感染的后期，作為回溯性診斷。而相對于ELISA 法而言，IFA 方法的特異性更高，所以經常用作MHV 的確診實驗，但IFA 法的結果判別偏主觀，不適合用于大量樣本的篩選[15]。

因此，對于實驗小鼠的MHV 感染檢測，選擇合適的ELISA 法檢測試劑盒特別重要。所以，檢測質量結果的精準與否跟檢測用試劑盒的標準化有著很大的關系。選擇的檢測方法、規范的操作技術和制定的標準化都對研究成果的可信度，精準性和科學性起著決定性的影響。西方歐美等國家已經推出了商業化，規范化，系統化的高品質檢測試劑盒，而我國MHV 檢測試劑盒的供應方主要集中在3 家左右，并且各個單位的側重方法不同，可選擇性比較小[16]。但進口的ELISA 試劑盒貨期較長并且價格昂貴，不足以應對突發情況下的檢測需求。廣西醫科大學選用了均為ELISA 方法的不同種類檢測試劑盒，其中兩種為國內生產的MHV 抗體試劑盒與外國的一款與之相對應的試劑盒，對這三種試劑盒從特異性、精準性、靈敏性和可靠性四個方面進行了比較，最終篩選出了一款既精準又經濟的，適合于學校動物實驗的國產MHV 抗體檢測試劑盒[17]。所以，我國MHV 檢測試劑盒的發展也在穩步前進，檢測結果的準確度，精準度，靈敏度同樣在穩步提升。

2.2 反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）

除了采用病毒分離培養、ELISA 法、IFA 法等血清學檢測方法外，RT-PCR 是用于檢測MHV 感染的最常用的方法，RT-PCR 是目前應用效果最好的確證方法之一。目前RT-PCR 的應用仍然存在著一些缺點如：對實驗室要求高，檢測周期長等，但RT-PCR 檢測病毒時所需的樣本量少、更是可以在疾病早期檢測到病毒感染，所以RT-PCR 檢測MHV 也得到了廣泛的重視[15]。

有實驗研究通過分析MHV 刺突蛋白的基因序列，分別構建了MHV 的兩種檢測方法：RT-PCR 和Real-time RT-PCR，實驗分別使用了小鼠的常見病毒和MHV 同屬不同型的冠狀病毒作為對照組進行實驗，最后確認了所構建方法的特異性，并且實驗證實了其所構建的檢測方法具有敏感的特異性，也經過了準確性試驗的證實，其構建的RT-PCR 方法和Real-time RT-PCR 方法都有很高的精準性和靈敏性。同時這兩種方法還具有廣泛的適應性，對于尿液、糞便和組織器官這不同的三種樣品檢測時均能測得良好的結果[18]。此檢測方法的研究將對實驗動物中MHV 的快速篩查，提高檢測效率和陽性檢出率奠定良好基礎。

3 MHV 的防治措施

通過目前已知的可感染小鼠的微生物和寄生蟲毒力的強弱，國際實驗動物科學協會（ICLAS）已經將這些微生物和寄生蟲分為從A 到E 的5 個等級，MHV 已經確定為B 等級，其毒力是可以導致小鼠死亡的程度。實驗小鼠的MHV 感染應引起廣大研究學者的高度重視，而對MHV 的防治措施更應該是重中之重。

3.1 定期監測，及早發現

MHV 感染實驗小鼠后常常為沒有臨床癥狀的隱性或慢性感染表現，在相應的環境下才會引起相應的臨床表現，所以要通過定時定點的檢測MHV 才能及時發現感染[19]。但是使用實驗小鼠的工作人員對實驗小鼠的健康程度重視不夠，尤其是對于外觀健康的小鼠很少進行MHV 的檢測。還有實驗小鼠的生產方從個人經濟效益出發，對實驗小鼠的MHV 感染情況監管不全面，不盡力，不嚴謹，從而造成了小鼠肝炎的傳染和漫延，并且我國實驗小鼠的傳染性疾病檢測數據很少，也不能實時，準確地反映國內實驗小鼠的MHV 感染狀況[20]。所以，在培育實驗小鼠，或者用實驗小鼠進行研究時，應定期檢測MHV 的感染情況，及早發現MHV 的感染才能在源頭減少實驗小鼠的損失，避免MHV 的感染對實驗研究的結果造成不良影響。

3.2 加強實驗人員的防控培訓，健全動物健康的測評體系

不單單是實驗小鼠的健康安全，從管控實驗室所用到的所有實驗動物健康出發，需要加強實驗人員對實驗動物健康的防控意識和能力，優化實驗人員的實驗動物健康培訓體系。要健全動物健康監測體系，改變實驗小鼠MHV 感染防控的被動局面，建立執行性好并且相對完善的動物健康監測系統是降低實驗動物感染MHV 的有效措施。還要探索適合各個實驗室的人員防控培訓和實驗動物健康監測體系，根據不同的地域，不同的實驗室，不同的研究方向，實時更新實驗動物的健康監測體系。要因地制宜，因“室”制宜，才能完善適合自己實驗室的監測體系，這樣才能有效地降低實驗小鼠感染MHV 的風險，避免實驗小鼠因感染MHV 而影響實驗進度，還可以提高實驗結果的準確性[21]。

3.3 增加對于MHV 感染治療或者預防的藥物研究

目前已有研究表明云南苦茶中主要成分水解型鞣酸單寧（Strictinin）對MHV 感染的小鼠L 細胞有抑制作用。此研究評估了一些茶化合物對小鼠MHV 感染情況的影響，研究表明Strictinin 顯著抑制了MHV 的感染，特別是在病毒附著或病毒進入后的時期，Strictinin 可以使MHV 核衣殼蛋白的表達和MHV 子代的產生顯著減少[22]。此研究還表明應該通過監測病毒復制步驟以及病毒感染過程中調節的細胞信號傳導途徑來進一步闡明在Strictinin 治療后觀察到顯著抑制作用的潛在機制[23]。對于治療或者預防MHV 感染的藥物研究應該引起研究學者的廣泛注意，因為MHV 感染可能代表HCoV-SARS 的感染，MHV 感染的實驗小鼠也被認為是SARS 的臨床相關模型[24]，所以對此治療藥物的研究不僅能對MHV 感染的實驗小鼠有益，還可以延伸到人類感染HCoV-SARS 的治療，實現研究的延伸。

4 總結與展望

MHV 具有極高的傳染性，當感染小鼠的群體免疫功能降低的時候，會使所有小鼠突然發生急性感染，從而導致實驗小鼠的大量死亡，最后嚴重影響實驗小鼠的生產和相關動物實驗的研究結果[20]。本文對MHV 的研究進展進行綜述，并介紹了MHV 的主要檢測方法和醫學防治措施，旨在有助于實驗研究人員了解MHV 的相關研究，并對MHV 的感染引起重視，加強對實驗小鼠MHV 感染的防治意識。在防治MHV 感染的方面，不僅是實驗研究人員需要注意，生產實驗小鼠的實驗動物機構也應該引起注意，嚴格監測MHV 的感染情況，才能有效控制MHV 的傳播和漫延。

如今實驗動物的安全性問題已經引起研究學者的重視，實驗動物安全保證對科研學者的生命健康及實驗結果的準確性起著決定性的影響。現在，MHV 的檢測技術在不斷發展，國內檢測MHV的試劑盒也在不斷更新，不斷完善，對于MHV 的治療藥物更是在研究的道路上不斷前行，其防治措施也引起了廣大實驗研究人員的注意。相信隨著對MHV 的深入研究，會更加清楚MHV 的發病機制和其影響因素，發現更多特異性更強、重復性更好和敏感性更高的檢測方法，研究出針對MHV 的特異性預防和治療藥物。■