基于半胱氨酸-Fe(Ⅲ)-鄰菲啰啉體系的共振光散射光譜法測定半胱氨酸的含量

劉 毅,袁 莉,袁嘉怡,儲 文,馬衛興,2*

(1.江蘇海洋大學 藥學院,連云港 222005;2.江蘇省海洋藥物篩選重點實驗室,連云港 222005)

半胱氨酸是一種含有巰基的非必需氨基酸,參與體內多種氧化還原反應,在人體生理過程中發揮著至關重要的作用,它在人體內的濃度水平與多種疾病相關[1-2]。半胱氨酸在食品、制藥、化妝品中的應用十分廣泛[3],因此建立省時、高效的檢測半胱氨酸的方法對于相關產品的質量控制具有重要意義。

目前,測定半胱氨酸含量的方法有分光光度法[4-5]、熒光光譜法[6-7]、電化學法[8-9]、高效液相色譜法[10-11]、滴定法[12-13]等,這些方法大多需要高精密儀器,操作繁瑣。共振光散射光譜法具有專屬性強、靈敏度高、省時、簡便等優點,相關應用也比較多[14-15],但是在半胱氨酸檢測中的應用較少。在弱酸性伯瑞坦-羅賓森(B-R)緩沖溶液中,Fe(Ⅲ)與1個鄰菲啰啉分子和4個水分子形成配合物陽離子,該配合物陽離子之間通過氫鍵形成配合物聚集體,從而產生共振光散射現象,在308 nm處出現強共振光散射峰[16]。當上述體系中存在半胱氨酸時,半胱氨酸能將溶液中游離的Fe(Ⅲ)還原成Fe(II)[17],Fe(II)奪取配合物聚集體中的鄰菲啰啉,發生金屬離子交換配位反應,使配合物聚集體解體,并形成更穩定的三鄰菲啰啉亞鐵配合物陽離子[Fe(C12H18N2)3]2+[16],導致體系共振光散射強度降低。基于上述作用機理,本工作提出了基于半胱氨酸-Fe(Ⅲ)-鄰菲啰啉體系的共振光散射光譜法測定半胱氨酸含量的方法,并將其應用于半胱氨酸膠囊的分析。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

F-7000型熒光分光光度計;BS210S型電子天平。

半胱氨酸標準儲備溶液:1.00 g·L-1,取適量半胱氨酸標準品,用水溶解和稀釋,搖勻備用。

半胱氨酸標準中間液:10.0 mg·L-1,取適量半胱氨酸標準儲備溶液,用水稀釋100倍,搖勻備用。

Fe(Ⅲ)溶液:取適量六水合氯化鐵,加入2 mL鹽酸,用水稀釋,配制成2.00 g·L-1Fe(Ⅲ)溶液。使用時,用水稀釋成10.0 mg·L-1Fe(Ⅲ)溶液。

鄰菲啰啉溶液:10.0 mg·L-1,取適量鄰菲啰啉,用水溶解和稀釋而成。

B-R緩沖溶液:pH 6.59,參考文獻[18]配制。

半胱氨酸標準品,純度不小于98.5%;六水合氯化鐵、鹽酸等試驗所用試劑均為分析純;試驗用水為超純水。半胱氨酸膠囊中的半胱氨酸標示量為72 mg·粒-1,批號分別為20210301和20211001。

1.2 試驗方法

取2批半胱氨酸膠囊各5粒,將內容物分別混合均勻后,分取適量樣品(相當于半胱氨酸4.00 mg)于燒杯中,用水溶解,轉移至棕色容量瓶中,用水定容至100 mL。用濾紙過濾,初濾液棄去,分取1.00 mL續濾液置于10 mL棕色容量瓶中,用水定容,制得4.00 mg·L-1的半胱氨酸樣品溶液。分取1.00 mL半胱氨酸樣品溶液、1.50 mL 10.0 mg·L-1的Fe(Ⅲ)溶液、1.00 mL B-R緩沖溶液(pH 6.59)、2.00 mL 10.0 mg·L-1鄰菲啰啉溶液于10 mL比色管中,以水定容,搖勻,室溫反應10 min,待測。隨同制備試劑空白。

分別取適量待測溶液和試劑空白置于1 cm石英比色皿中,調節儀器激發、發射波長(λ)相等,狹縫寬度為5 nm,掃描200～800 nm內共振光散射光譜,記錄上述熒光體系在308 nm處的共振光散射強度I和I0,并計算共振光散射強度差值ΔI(ΔI=I-I0),利用標準曲線法定量。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

含0, 0.40, 0.80, 1.00, 1.20 mg·L-1半胱氨酸的熒光體系的共振光散射光譜圖見圖1。

曲線1～5對應的半胱氨酸質量濃度分別為0, 0.40, 0.80, 1.00, 1.20 mg·L-1

由圖1可知,熒光體系中的最大共振光散射峰出現在308 nm處,且308 nm處的共振光散射強度隨著半胱氨酸質量濃度的增加而逐漸減小,因此試驗選擇308 nm為檢測波長。

2.2 緩沖溶液及其酸度、用量的選擇

試驗考察了分別以三羥甲基氨基甲烷(Tris)-鹽酸、乙酸-乙酸鈉、B-R等3種緩沖溶液作介質時對含1.00 mg·L-1半胱氨酸熒光體系ΔI的影響。結果顯示,熒光體系的ΔI在B-R緩沖溶液中最大,因此試驗選擇B-R緩沖溶液進行共振散光射光譜測試。

試驗進一步考察了B-R緩沖溶液酸度(pH 6.09,6.37, 6.59, 6.80, 7.00, 7.24)和其用量(0.25, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25, 1.50 mL)對含1.00 mg·L-1半胱氨酸的熒光體系的ΔI的影響,結果見圖2。

圖2 B-R緩沖溶液酸度和用量對熒光體系ΔI的影響Fig.2 Effects of acidity and amount of B-R buffer solution on the ΔI of the fluorescence system

由圖2可知,熒光體系的ΔI在B-R緩沖溶液的酸度為pH 6.59以及用量為0.75～1.00 mL時最大。因此,試驗選擇B-R緩沖溶液酸度為pH 6.59,用量為1.00 mL。

2.3 Fe(Ⅲ)溶液用量的選擇

試驗考察了Fe(Ⅲ)溶液用量分別為0.50, 1.00, 1.25, 1.50, 1.75, 2.00 mL時對含1.00 mg·L-1半胱氨酸的熒光體系的ΔI的影響,結果見圖3。

圖3 Fe(Ⅲ)溶液用量對熒光體系ΔI的影響Fig.3 Effect of amount of Fe(III) solution on the ΔI of the fluorescence system

由圖3可知,熒光體系的ΔI在Fe(Ⅲ)溶液用量為1.50 mL時最大,因此試驗選擇Fe(Ⅲ)溶液用量為1.50 mL。

2.4 鄰菲啰啉溶液用量的選擇

試驗考察了鄰菲啰啉溶液用量分別為0.50, 1.00, 1.50, 1.75, 2.00, 2.25, 2.50, 3.00 mL時對含1.00 mg·L-1半胱氨酸的熒光體系的ΔI的影響,結果見圖4。

圖4 鄰菲啰啉溶液用量對熒光體系ΔI的影響Fig.4 Effect of amount of o-phenanthroline solution on the ΔI of the fluorescence system

由圖4可知,熒光體系的ΔI在鄰菲啰啉溶液用量為2.00 mL時最大,因此試驗選擇鄰菲啰啉溶液用量為2.00 mL。

2.5 反應時間的選擇

試驗考察了反應時間為0～60 min時對含1.00 mg·L-1半胱氨酸的熒光體系的共振光散射強度的影響。結果顯示,反應時間不小于10 min時,熒光體系的ΔI達到最大且在60 min內基本不變,說明本方法的穩定性較好。因此,試驗選擇反應時間為10 min。

2.6 標準曲線與檢出限

分別取0.20, 0.40, 0.60, 0.80, 1.00, 1.20 mL 10.0 mg·L-1半胱氨酸標準中間液于比色管中,按照試驗方法測定, 以處理后熒光體系中半胱氨酸的質量濃度(0.20, 0.40, 0.60, 0.80, 1.00, 1.20 mg·L-1)為橫坐標,其對應的ΔI為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示, 半胱氨酸的質量濃度在0.20～1.20 mg·L-1內和ΔI呈線性關系,線性回歸方程為y=3 051x+64.13,相關系數為0.999 0。

按照試驗方法平行測定試劑空白11次,以3倍I的標準偏差(s)與標準曲線斜率(k)的比值計算檢出限(3s/k),結果為0.09 mg·L-1。

2.7 干擾試驗

在分析含1.00 mg·L-1半胱氨酸的熒光體系時,考察了含半胱氨酸質量濃度500倍的胱氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酸、硬脂酸鎂、淀粉、甘氨酸、桂皮酸、L-丙氨酸以及含其質量濃度1 000倍的山梨酸、葡萄糖等共存組分對半胱氨酸測定的影響。結果顯示,在相對誤差絕對值不超過5.0%條件下,共存組分對半胱氨酸的測定不造成干擾,可見本方法對半胱氨酸的選擇性較好。

2.8 精密度和回收試驗

按照試驗方法重復分析含1.00 mg·L-1半胱氨酸的熒光體系10次,計算測定值的相對標準偏差(RSD)。結果顯示:測定值的RSD為1.9%,說明儀器精密度較高。

按照試驗方法分析2批實際樣品,并進行兩個濃度水平的加標回收試驗,計算回收率和測定值的RSD,結果見表1。

表1 精密度和回收試驗結果

由表1可知,不同批號半胱氨酸膠囊樣品中半胱氨酸的測定值與標示值基本一致,回收率為97.8%～102%,測定值的RSD均小于3.0%,符合定量分析的要求。

本工作采用基于半胱氨酸-Fe(Ⅲ)-鄰菲啰啉體系的共振光散射光譜法測定半胱氨酸的含量,方法操作簡單、專屬性強、精密度好、準確度高,可推廣應用于食品及其他藥物中半胱氨酸含量的測定。

致謝：感謝江蘇省品牌專業二期工程(省特色專業-藥物制劑,編號65);2021年江蘇省首批一流本科課程(線下一流課程-藥物分析,序號104);江蘇海洋大學研究生科研與實踐創新計劃(KYCX2021-083)等項目對本工作的大力支持。