分散固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定不同品種柑橘果實(shí)不同部位中3種檸檬苦素類似物的含量

秦蕓樺,鐘世歡,陳青俊,王 京,王 岳,葉佳明,陳云義,孫崇德

(1.贊宇科技集團(tuán)股份有限公司,杭州 310030;2.浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司,杭州 311305; 3.浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310009; 4.浙江大學(xué) 果實(shí)品質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310058)

柑橘果實(shí)中含有多種有益于人體健康的物質(zhì),如維生素、礦物質(zhì)、纖維素以及類胡蘿卜素、類黃酮、檸檬苦素類似物等次生代謝物質(zhì)。其中,檸檬苦素類似物是一類含有呋喃環(huán)的以異戊二烯為基本結(jié)構(gòu)單元的高度氧化的四環(huán)三萜類化合物,是柑橘果實(shí)中的重要功能性成分,也是產(chǎn)生苦味的主要物質(zhì)之一。檸檬苦素類似物具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎、除蟲(chóng)殺蟲(chóng)、抗氧化性、抗菌、降血糖以及預(yù)防心血管疾病等作用[1-4]。

目前,檸檬苦素類似物的檢測(cè)方法主要有熒光檢測(cè)法[5]、分光光度法[6]、放射性免疫測(cè)定法[7]、液相色譜法[8-12]、液相色譜-質(zhì)譜法[13-14]等。不同品種柑橘果實(shí)的不同部位中檸檬苦素類似物的種類和含量具有較大差異性,而上述方法檢測(cè)對(duì)象多局限于柑橘果實(shí)的單一部位,且同時(shí)檢測(cè)檸檬苦素、諾米林和黃柏酮等檸檬苦素類似物的報(bào)道較少;柑橘果實(shí)基質(zhì)復(fù)雜,采用液相色譜法測(cè)定時(shí),無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定低含量樣品[15];采用液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定時(shí),檢測(cè)對(duì)象多為干燥樣品和發(fā)酵液,缺乏新鮮樣品的相關(guān)研究。為實(shí)現(xiàn)不同品種柑橘果實(shí)的不同部位中檸檬苦素類化合物種類和含量的比較和鑒別,本工作提出了分散固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定不同品種柑橘果實(shí)的不同部位中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的含量,可為柑橘果實(shí)中檸檬苦素類化合物在食品、醫(yī)藥、畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中合理高效的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)與技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1260Ⅱ-6495型液相色譜-質(zhì)譜儀;Centrifuge 5804R型冷凍離心機(jī);MultiReax型渦旋振蕩器;EVAP11型氮吹儀;Milli-Q型純水儀;KH-5000B型超聲波儀。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:100 mg·L-1,取0.01 g檸檬苦素、諾米林、黃柏酮標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈溶解并定容至100 mL,搖勻備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用初始流動(dòng)相逐級(jí)稀釋,配制成檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的質(zhì)量濃度為0.10, 0.50, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

檸檬苦素、諾米林、黃柏酮標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于99%;乙腈、丙酮、甲酸均為色譜純;石油醚、硫酸鎂、氯化鈉、二氯甲烷均為分析純;增強(qiáng)型去脂吸附劑EMR-Lipid;石墨化碳黑(GCB);試驗(yàn)用水為超純水。

30個(gè)柑橘果實(shí)樣品均采摘于種植基地,包含12個(gè)柚類品種(楚門(mén)文旦、奧郎布朗科葡萄柚、強(qiáng)德勒柚、脆香甜柚、安江香柚、五布紅心柚、早熟暹羅柚、大庸菊花芯(柚)、金堂無(wú)核柚、上杭蜜柚、馬家柚、舒化柚),5個(gè)柑類品種[華農(nóng)本地早(柑)、無(wú)籽甌柑、口之津(柑)、沙柑、沅江建柑],8個(gè)橘類品種[陽(yáng)山橘、八月橘、蔓生紅橘、安江紅橘、年橘、川田(橘)、靜岡1080(橘)、白川溫州(橘)],5個(gè)橙類品種[伏令夏橙、金山橙、晚熟6號(hào)(橙)、江津長(zhǎng)葉橙、摩洛哥酸橙]。將各品種果實(shí)的油胞層、白皮層、囊衣、果肉進(jìn)行分離,分別冷凍粉碎后于-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

CAPCELL PAK ADME HR色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.0 μm);柱溫35 ℃;流量0.3 mL·min-1;進(jìn)樣量10 μL;流動(dòng)相A為0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～5.0 min,B為10%;5.0～7.0 min,B 由10%升至25%;7.0～9.0 min,B 由25%升至45%;9.0～12.0 min,B由45%升至75%;12.0～15.0 min,B由75%升至95%,保持3.0 min;18.0～18.5 min,B由95%降至10%。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子(ESI)源,正離子(ESI+)掃描模式;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;鞘氣流量10 L·min-1;干燥氣流量8 L·min-1;干燥氣溫度300 ℃;霧化氣壓力0.21 MPa;毛細(xì)管電壓4 000 V;裂解電壓166 V。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1,“*”代表定量離子對(duì)。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

1.3 試驗(yàn)方法

取5.0 g均質(zhì)后的樣品于50 mL離心管中,加入5 mL水,渦旋混勻后加入20 mL體積比5∶5的丙酮-乙腈混合溶液,混勻后超聲提取10 min,以8 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min,收集上清液。用3 mL水活化2 g EMR-Lipid吸附劑,加至上清液中,渦旋30 s,加入5 g質(zhì)量比1∶4的氯化鈉-硫酸鎂混合物和15 mg GCB,迅速搖勻,以8 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心1 min。吸取全部上清液,于40 ℃氮吹至干,殘?jiān)?0.0 mL初始流動(dòng)相復(fù)溶,過(guò)0.22 μm濾膜,濾液供LC-MS/MS測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Agilent MassHunter軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖譜處理,采用Microsoft Excel 與Origin lab軟件繪制圖表;試驗(yàn)數(shù)據(jù)為至少重復(fù)測(cè)定3次的結(jié)果,采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用方差分析進(jìn)行多組數(shù)據(jù)鑒定比較,采用Tukey法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在ESI+全掃描(SCAN)模式下,依次進(jìn)樣分析1.0 mg·L-1檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的單標(biāo)準(zhǔn)溶液,3種待測(cè)物均形成了準(zhǔn)分子離子[M+H]+。啟用離子漏斗模塊,在產(chǎn)物離子掃描(Product Ion)和MRM模式分析中選擇定性離子對(duì)和定量離子對(duì),同時(shí)優(yōu)化碰撞能量,使各特征離子對(duì)的響應(yīng)達(dá)到最大,優(yōu)化的結(jié)果見(jiàn)1.2.2節(jié)。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

檸檬苦素類似物的結(jié)構(gòu)相近,在二級(jí)質(zhì)譜中均會(huì)產(chǎn)生m/z161子離子碎片,對(duì)色譜分離能力有一定要求。試驗(yàn)考察了ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm × 2.1 mm , 1.8 μm)、CAPCELL PAK ADME HR色譜柱(100 mm × 2.1 mm, 2.0 μm)、XBridge C18色譜柱(100 mm× 2.1 mm, 1.7 μm)作為固定相時(shí)對(duì)3種待測(cè)物分離效果的影響。結(jié)果顯示:在梯度洗脫條件下,3種化合物均能有效分離,但XBridge C18色譜柱(100 mm× 2.1 mm, 1.7 μm)和ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm × 2.1 mm , 1.8 μm)對(duì)系統(tǒng)壓力要求更高,且分析時(shí)間更長(zhǎng)。綜合考慮,試驗(yàn)選擇采用CAPCELL PAK ADME HR色譜柱(100 mm × 2.1 mm, 2.0 μm)作固定相。

以乙腈-水、甲醇-水、乙腈-甲酸溶液、甲醇-甲酸溶液、乙腈-甲酸銨溶液、甲醇-甲酸銨溶液體系作流動(dòng)相,比較了不同體系下3種待測(cè)物的靈敏度和分離度。結(jié)果顯示:在ESI+掃描模式下,在水相中添加一定量甲酸能顯著提高待測(cè)物的離子化效率,當(dāng)甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí)3種待測(cè)物的靈敏度和分離度均最佳;在水相中加入甲酸銨也能顯著提高待測(cè)物的離子化效率,且增強(qiáng)效果和甲酸的基本相當(dāng),但是添加甲酸更為簡(jiǎn)便;與甲醇相比,乙腈具有更強(qiáng)的反相洗脫能力,更小的基線噪音,且其極性與待測(cè)物的更接近。綜上,試驗(yàn)選擇的流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸溶液體系。

按照試驗(yàn)方法分析大庸菊花芯(柚)油胞層,其中的3種檸檬苦素類似物的典型色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 3種檸檬苦素類似物的色譜圖Fig.1 Chromatograms of the 3 limonin analogues

2.3 預(yù)處理方法的選擇

柑橘果實(shí)中含大量的有機(jī)酸、糖類、色素、黃酮等物質(zhì),在液相色譜-質(zhì)譜的離子化過(guò)程中會(huì)與待測(cè)物競(jìng)爭(zhēng)電子,從而引起較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng),影響待測(cè)物的準(zhǔn)確測(cè)定。在優(yōu)化的儀器工作條件下,選擇有效降低基質(zhì)效應(yīng)的預(yù)處理方法至關(guān)重要。檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的極性較弱,基質(zhì)干擾物質(zhì)主要是出峰時(shí)間相近的脂質(zhì)等弱極性物質(zhì),需要通過(guò)優(yōu)化提取、凈化等條件降低基質(zhì)干擾。對(duì)于天然植物樣品,常用的提取方法有超聲、回流等,常用的提取溶劑主要有甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷等[6-13]。基于上述文獻(xiàn),進(jìn)行了提取方法、提取溶劑和分散固相萃取吸附劑的優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3.1 提取方法

以加標(biāo)舒化柚的油胞層樣品(加標(biāo)量50 mg·kg-1)為待測(cè)對(duì)象,試驗(yàn)比較了分散固相萃取法、超聲溶劑萃取法、回流溶劑萃取法(分別標(biāo)記為方法1#、方法2#和方法3#)下加標(biāo)樣品中3種待測(cè)物的回收率,結(jié)果見(jiàn)圖2。其中:參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行超聲溶劑萃取,即取經(jīng)均質(zhì)的樣品5.0 g,置于250 mL燒瓶中,加入40 mL石油醚(30～60 ℃),于40 ℃超聲脫脂30 min,抽濾后棄去濾液,加入50 mL丙酮,于40 ℃超聲提取30 min,濾紙過(guò)濾,濾液氮吹至干,用10 mL 50%(體積分?jǐn)?shù))乙腈溶液復(fù)溶,過(guò)0.22 μm濾膜,濾液供LC-MS/MS分析;參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行回流溶劑萃取,即取經(jīng)均質(zhì)的樣品5.0 g,置于250 mL燒瓶中,加入60 mL二氯甲烷,于50 ℃回流提取1 h,過(guò)濾,將濾液于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,加入10 mL乙腈溶解殘?jiān)?過(guò)0.22 μm濾膜,濾液供LC-MS/MS分析;圖2柱子上方不同字母a, b代表P<0.05水平下的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 不同提取方法下3種檸檬苦素類似物的回收率Fig.2 Recoveries of the 3 limonin analogues under different extraction methods

由圖2可知,超聲溶劑萃取法和回流溶劑萃取法所得3種待測(cè)物的回收率均小于60.0%,而分散固相萃取法所得回收率大于80.0%。因此,試驗(yàn)選擇的提取方法為分散固相萃取法。

2.3.2 提取溶劑

對(duì)甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷等的提取效果進(jìn)行考察時(shí)發(fā)現(xiàn):以丙酮、二氯甲烷提取時(shí),提取液中存在較多的色素、脂質(zhì)等共提取物,尤其是油胞層和囊衣部位,后續(xù)凈化難度較高;以油胞層為待測(cè)對(duì)象,以甲醇、乙腈提取時(shí)黃柏酮的單次提取回收率小于50.0%;以丙酮和乙腈的混合溶液提取時(shí),3種待測(cè)物的提取回收率相對(duì)較高。因此,試驗(yàn)進(jìn)一步考察了丙酮和乙腈的體積比分別為1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1時(shí)對(duì)2.3.1節(jié)加標(biāo)樣品中3種待測(cè)物回收率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同體積比丙酮和乙腈的混合溶液下3種檸檬苦素類似物的回收率Fig.3 Recoveries of the 3 limonin analogues under acetone and acetonitrile mixed solutions with different volume ratios

由圖3可知,混合溶液中丙酮和乙腈體積比為 5∶5時(shí)3種待測(cè)物的回收率均大于80.0%,因此試驗(yàn)選擇的提取溶劑為體積比5∶5的丙酮-乙腈混合溶液。

2.3.3 分散固相萃取吸附劑

分散固相萃取技術(shù)凈化效果好、操作簡(jiǎn)便、效率高,是色譜分析中常用的凈化手段,常用的吸附劑有十八烷基鍵合硅膠(C18)、N-丙基乙二胺固相吸附劑(PSA)、聚酰胺粉、GCB、活性炭、氧化鋁、硅酸鎂、EMR-Lipid等。其中:C18主要用于吸附脂質(zhì),親脂類待測(cè)物的回收率偏低;GCB主要用于吸附色素,但對(duì)具有平面結(jié)構(gòu)的待測(cè)物也存在共吸附;氧化鋁包括酸性、中性和堿性氧化鋁,根據(jù)其酸堿性的不同,可用來(lái)分離不同酸度化合物,其專一性較差;EMR-Lipid是基于體積排阻和疏水相互作用機(jī)制來(lái)去除脂質(zhì)的,可吸附脂質(zhì)中C5及具有更長(zhǎng)碳鏈的物質(zhì),具有高選擇性、高效率的特點(diǎn)。根據(jù)檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的化學(xué)性質(zhì),試驗(yàn)考察了分別以C18、中性氧化鋁、EMR-Lipid等3種脫脂型吸附劑凈化時(shí)對(duì)2.3.1節(jié)加標(biāo)樣品中3種待測(cè)物回收率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4。其中,不同字母a, b, c代表P<0.05水平下的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 不同吸附劑下3種檸檬苦素類似物的回收率Fig.4 Recoveries of the 3 limonin analogues with different adsorbents

由圖4可知,C18和中性氧化鋁對(duì)黃柏酮的吸附較明顯,其回收率僅為57.1%和51.9%,而EMR-Lipid對(duì)檸檬苦素、諾米林、黃柏酮均無(wú)明顯吸附,且回收率均大于90.0%。因此,試驗(yàn)選擇的吸附劑為EMR-Lipid。

利用EMR-Lipid吸附劑除脂后,部分樣品需加入適量GCB去除樣品溶液中的色素,因此試驗(yàn)進(jìn)一步考察了GCB用量(5,15,30 mg)對(duì)2.3.1節(jié)加標(biāo)樣品中3種待測(cè)物回收率的影響。結(jié)果顯示:加入5 mg GCB時(shí),檸檬苦素的回收率小于60.0%,且樣品溶液顏色較深;加入15 mg GCB時(shí),3種待測(cè)物的回收率均大于90.0%,且樣品溶液較為澄清透明;加入30 mg GCB時(shí),樣品溶液完全澄清透明,但共吸附情況顯著,待測(cè)物的平均回收率不到40.0%。因此,試驗(yàn)選擇加入的GCB用量為15 mg。

2.3.4 優(yōu)化的預(yù)處理?xiàng)l件消除基質(zhì)效應(yīng)的效果

由于空白樣品溶液無(wú)法獲取,試驗(yàn)以加標(biāo)舒化柚的油胞層樣品(加標(biāo)量10.0 mg·L-1)為待測(cè)對(duì)象,比較了分別以標(biāo)準(zhǔn)加入法[16]和本方法測(cè)定時(shí)檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的回收率。結(jié)果顯示:采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定時(shí),檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的回收率為93.2%, 94.5%和91.9%;采用本方法測(cè)定時(shí),上述3種待測(cè)物的回收率為90.5%, 97.1%和92.4%,本方法的回收率和標(biāo)準(zhǔn)加入法的基本一致,均達(dá)到90.0%以上,說(shuō)明上述優(yōu)化的預(yù)處理?xiàng)l件消除基質(zhì)效應(yīng)的效果較好。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

按照儀器工作條件測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以各待測(cè)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,各待測(cè)物的質(zhì)量濃度均在0.10～10.0 mg·L-1內(nèi)和對(duì)應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系,其他線性參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限

分別以3, 10倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(3S/N)和測(cè)定下限(10S/N),所得結(jié)果見(jiàn)表2,同時(shí)與液相色譜法[26]的檢出限進(jìn)行比較,結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知,本方法的檢出限低于文獻(xiàn)報(bào)道方法的,滿足實(shí)際樣品的分析需求。

2.4.2 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)五布紅心柚的油胞層、白皮層、囊衣、果肉等4個(gè)部位進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 精密度和回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

由表3可知,3種待測(cè)物的回收率為83.1%～90.5%,測(cè)定值的RSD為2.6%～5.6%,表明該方法具有較好的精密度和準(zhǔn)確度,能滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)需要。

2.5 樣品分析

采用本方法對(duì)30個(gè)品種柑橘果實(shí)樣品的不同部位中3種檸檬苦素類似物的含量進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)部位各測(cè)定3次,所得結(jié)果見(jiàn)表4。其中,柑類、橘類、橙類等柑橘果實(shí)的囊衣部位樣品量較小,無(wú)法用本方法進(jìn)行分離測(cè)定,表4僅顯示柑橘果實(shí)其他3個(gè)部位的結(jié)果。

表4 不同品種柑橘果實(shí)不同部位中檸檬苦素類似物的測(cè)定值

由表4可知,不同品種柑橘果實(shí)的不同部位中3種檸檬苦素類似物含量和分布差異顯著。比較不同品種柑橘果實(shí)中3種檸檬苦素類似物總含量,由大到小排序依次為柚類、柑類、橙類、橘類品種,其中柚類品種中早熟暹羅柚(1 513 mg·kg-1)、強(qiáng)德勒柚(1 452 mg·kg-1)和舒化柚(1 437 mg·kg-1)中檸檬苦素類化合物的總測(cè)定值較高,柑類品種中無(wú)籽甌柑檸檬苦素類化合物的總測(cè)定值較高,橙類品種摩洛哥酸橙中檸檬苦素類似物總測(cè)定值(761 mg·kg-1)較高,而橘類品種靜岡1080(橘)中檸檬苦素類似物總測(cè)定值(11.6 mg·kg-1)最低。比較不同部位中3種檸檬苦素類似物的總含量,柚類品種中檸檬苦素類似物主要分布在囊衣部位,柑類、橙類、橘類品種中檸檬苦素類似物主要分布在白皮層和油胞層部位。比較30種柑橘果實(shí)中檸檬苦素類似物的種類、柚類中檸檬苦素類似物主要以檸檬苦素、諾米林為主,黃柏酮含量較低;柑類、橙類、橘類中檸檬苦素類似物主要以檸檬苦素為主,黃柏酮檢出率較低。

本工作提出以分散固相萃取- LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定柑橘果實(shí)中3種檸檬苦素類似物的含量,有效解決了柑橘果實(shí)不同部位的基質(zhì)干擾,且方法簡(jiǎn)便、快速、檢出限低。方法用于30個(gè)不同品種柑橘果實(shí)的不同部位中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮等3種檸檬苦素類似物的檢測(cè),檸檬苦素類似物的含量在品種、部位分布上差異顯著。本方法可為柑橘果實(shí)中檸檬苦素類似物的鑒別、資源評(píng)價(jià)及應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支撐。