羊臨床副結核的發病機制、診斷和控制措施

趙太革

（山東省沂水縣諸葛牧獸醫工作站 山東臨沂 276400）

副結核（Johne's disease）是一種全球重要的慢性細菌性疾病，主要發生在家養和野生反芻動物身上，由鳥類分枝桿菌亞種（mycobacterium avium subsp.paratuberculosis）引起。這種疾病于1895年在歐洲首次在牛中報道，并在發達國家和部分發展中國家廣泛蔓延，特別是在牛乳業中[1]。小型反芻動物感染也被認為呈世界性分布，如綿羊和山羊等，感染的野生反芻動物包括羊駝、鹿、野牛和麋鹿等[1]。副結核感染在世界范圍內普遍存在，主要在溫和潮濕地區。已廣泛報道羊副結核疾病的國家包括澳大利亞、新西蘭、南非、英國、法國、挪威、瑞士、加拿大和美國[1]。由于缺乏標準化診斷技術，大多數國家的實際畜群患病率不得而知。事實上，不同的診斷技術被用來估計患病率，如糞便培養，組織培養，或抗體酶聯免疫吸附實驗，但這些方案都還沒有標準化。此外，由于這些診斷技術缺乏特異性和敏感性，對確切患病率的評估受阻礙。

這種疾病很容易被認為是水樣腹瀉和體重下降，與牛的臨床癥狀不同，該疾病在小型反芻動物群中更為隱蔽，感染動物表現出漸進性的體重下降和運動減少，一些感染動物的糞便松軟[2]。致病性微生物在環境中的持續存在，缺乏足夠的疫苗應用，以及已有的疫苗被認為具有低于預期的效力，使得疾病控制變得復雜。由于過早撲殺或死亡、產奶量減少和生育率下降，副結核給畜牧業造成了巨大的經濟損失。廣受關注的還有副結核和人類炎癥性腸病（包括克羅恩病）之間的潛在的人畜共患病聯系，副結核和克羅恩病之間的關系長期以來一直存在爭議，但最近分離和基因組技術的改進提供了證據，副結核可能是克羅恩病發展的一個觸發因素，通過遺傳、感染和免疫等復雜的相互作用[2]。如果副結核病原最終被確認為一種人畜共患病原體，那么公眾對乳制品的消費信心備受影響。

1 發病機制

綿羊和山羊副結核病涉及腸道和淋巴器官的慢性炎癥性病變，主要由“S 型”（綿羊，sheep）、“C 型”（牛，cattle）或“野牛型”（bison）鳥類分枝桿菌亞種引起[2]。S 型菌株主要導致綿羊或產毛山羊的副結核病，C 型菌株主要與奶山羊感染有關，迄今為止，“野牛型”只在婆羅門牛（brahman cattle）報道過。綿羊也很容易感染C 型菌株，而且有人認為S 型菌株的分布和感染率被低估了。牛似乎對S型菌株感染具有一定的抵抗力，盡管在澳大利亞，與嚴重感染的綿羊接觸的小牛也被感染了。在對副結核感染模型的評估中，包括通過死后檢查和幼年感染的綿羊、山羊和牛的組織培養確定成年感染狀況，發現牛對C 型菌株和S 型菌株的易感度低于山羊和綿羊，山羊被認為抗感染能力最低[2]。

最近一項研究在1.5 個月大的實驗感染Assaf 羔羊中檢測C 型菌株和S 型菌株，發現感染C 型菌株的動物產生的特異性抗體和干擾素γ（IFNγ）明顯更高，而在感染S 型菌株的動物中沒有觀察到一致的IFNγ 反應[2]。感染S 型菌株的羊出現于淋巴組織的肉芽腫病變，病變強度隨時間的變化無差異，C 型菌株感染病變的特征是邊界清晰的肉芽腫和纖維化，隨著感染的進展，病變的嚴重程度趨于降低。

副結核感染主要由糞口途徑接觸引起，經腸道進入淋巴系統，駐留在回腸Peyer's 斑塊上的M 細胞中。具體可能的途徑包括：攝入受感染動物的糞便，特別是粘上糞便的乳頭上，以及暴露于糞便污染的飼料、水或干草。鳥類分枝桿菌亞種也會從牛、綿羊和山羊的初乳和乳汁中排出，因此飲用受污染的初乳或牛奶也可能引起副結核疾病的傳染。副結核感染的新生羔羊經診斷小于1%，但患有亞臨床或臨床副結核疾病的奶牛的患病率估計分別為9%和39%[3]。因此，對于環境微生物的管理對于副結核疾病的控制至關重要，副結核病原可能在環境中持續存在，可能存活約一年，存活時間取決于各種環境因素。由于這種在環境中持續存活的能力，衛生措施是重要的遏制手段。

在綿羊中觀察到三種不同形式的副結核疾病：多菌性、少菌性和無癥狀感染。多菌性形式的副結核疾病的病變特征是慢性肉芽腫性腸炎和淋巴結炎（尤其涉及腸系膜淋巴結），腸固有層和黏膜下層的上皮樣巨噬細胞積聚大量病原[3]。少菌性形式的副結核疾病的病變在本質上是淋巴細胞性的，腸道病變通常在最初檢測到副結核病原后6～12 個月內出現，盡管有些病羊可能在感染后12 個月內發展成嚴重病變[3]，但更多病羊可能以不同的速率從輕度少菌性形式發展到嚴重和多菌性形式，在這個階段內，炎癥浸潤的嚴重程度可能會發生波動。少菌性形式的副結核，有些病羊可能能夠暫時或永久地清除感染，特別是在病原感染的早期階段。無癥狀感染是那些已經控制感染或清除了病原的動物。

發生以淋巴細胞病變為主的少菌性形式的副結核疾病的羊更有可能產生Th-1 細胞介導免疫反應。在患有多菌性形式的副結核疾病的羊中，病變通常以巨噬細胞為主，這些羊往往具有很強的Th-2體液抗體反應，這些特征表明多菌性形式的病變可能與細胞介導的免疫反應減弱有關。無癥狀感染的動物也是值得關注的，因為它們產生了一種介于非感染和少菌性形式的副結核疾病之間的免疫反應，在細胞水平上，這些動物血液和腸道相關淋巴結中的CD4+、CD25+T細胞和B 細胞數量增加，血液和組織中的B 細胞數量增加[3]。

2 診斷

診斷副結核的最大挑戰之一是難以用敏感性診斷技術準確識別，往往無法識別潛在和亞臨床的副結核。副結核最明確的診斷方法是經組織病理學的死后評估，尋找脂肪儲備耗竭、腸壁增厚和腸道相關淋巴管腫大為特征的解剖病理變化，包括回腸和盲腸漿膜表面存在所謂的“淋巴管”[4]。診斷技術還包括抗體的血清學測定（酶聯免疫吸附試驗、補體固定試驗、瓊脂凝膠免疫擴散試驗）、細胞介導免疫的細胞測定（淋巴細胞增殖或轉化試驗、皮內皮膚試驗、IFNγ 試驗）以及糞便培養和聚合酶鏈反應（PCR），現在包括定量實時PCR（qPCR）。這些診斷技術的敏感性較低，受感染階段和所使用的商品試劑盒類型的影響。奶樣使用酶聯免疫吸附試驗可作為首選診斷工具，因為奶取樣是非破壞性、快速和簡單的。目前用于副結核的診斷技術敏感性和特異性較差，大多數只能在感染后期檢測之外，還無法確定感染病原菌亞種中的哪一種。

副結核感染可能是間歇性的，生物體的脫落糞便中含有病原菌，往往先于血清學反應。患有副結核的綿羊平均每天通過糞便脫落上千個病菌，即使稀釋100 倍，這些病菌也可以在培養皿中恢復。糞便培養對羊群水平檢測的敏感性很高，能達到92%，遠遠優于常規的血清學檢測，要達到類似的敏感性，需要對2～3 倍數量的羊進行血液采樣[4]。

3 控制措施

由于沒有可用的疫苗。控制措施主要是規范生物安全措施減少環境中的病原菌，應用檢測技術和撲殺來消除感染源。規范生物安全措施，對于許多養殖企業而言，在財政上可能不可行，尤其是這些措施可能不會立即產生有利的結果，如果沒有得到大量的推廣，不太可能得到廣泛實施。首次接觸時的年齡被確定為后續病變發展的重要決定因素，感染同等時間后，羔羊發生嚴重病變的幾率比成年羊高3 倍，羔羊感染后死亡率是成年羊的5 倍[4]。因此，對于放牧飼養，應集中精力限制幼畜與環境的接觸，并降低牧場的污染程度。對糞便-口腔傳播途徑的嚴格管理以防止幼畜接觸感染。

檢測和撲殺策略取決于有效的診斷技術，充分檢出早期感染的動物，最好在病原菌開始糞便脫落之前。然而，由于目前的診斷技術仍舊存在相應的不足，且通常靈敏度較低，考慮到使用成本，酶聯免疫吸附技術得到了相對廣泛的推廣，這也是當前最適用于羊群或牛群的診斷工具。陰性測試結果并不能確保動物沒有感染副結核，需要在長時間內間歇性進行多次測試，以獲得羊群或牛群的真實感染率[4]。

通過生物安全管理和診斷撲殺未能產生預期的結果，因此疫苗接種成為副結核控制的發展重點，尤其是在小型反芻動物中。接種疫苗后，能顯著減少臨床病例的發生以及受感染動物的糞便排泄。當前疫苗研制還停留在實驗室階段，尚未有商業疫苗面試。在以實驗室疫苗控制副結核方面，一個較少受到關注的方面是何時接種疫苗，一般的建議是在出生后的幾天內接種疫苗，在感染前對動物進行免疫，但成年后接種疫苗可能更可取，因為這樣更容易管理，也因為免疫系統處于更成熟的階段。■