豬偽狂犬病毒特點(diǎn)及分離鑒定

王秀麗，薄智勇，王艷鳳，郭寶，陳學(xué)杰，戰(zhàn)玉清

（青島易邦生物工程有限公司 山東青島 266113）

仔豬感染本病后主要表現(xiàn)為高熱、腹瀉、嘶鳴以及四肢劃水等精神癥狀，可造成患病仔豬較高的死亡率；公豬感染本病后，主要會對生殖系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷，表現(xiàn)為睪丸炎，精液品質(zhì)降低等情況；成年豬或者育肥豬感染本病后，在初期會有明顯的高熱現(xiàn)象，隨后出現(xiàn)呼吸困難等癥狀，即使是耐過后的豬只，仍然會在一定時期內(nèi)帶毒，呈現(xiàn)隱性感染情況；若是妊娠期的母豬感染本病，則容易發(fā)生流產(chǎn)、死胎或者木乃伊胎等情況，若控制不當(dāng)或者未能及時控制住疫情蔓延，則會給生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來非常嚴(yán)重的危害，在實(shí)際的養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，需加強(qiáng)對豬偽狂犬病毒的分離鑒定工作，進(jìn)而為后續(xù)的診療提供可靠的依據(jù)。隨著生物科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，豬偽狂犬病毒的檢測方法也在不斷地更新，當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室檢測中常用的包括中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附等均能夠?qū)⒉《具M(jìn)行有效區(qū)分、鑒別，為養(yǎng)殖場病毒的凈化和生物安全防控提供可能。

1 豬偽狂犬病毒的特點(diǎn)

1.1 病原特性

豬偽狂犬病毒（PRV）是皰疹病毒科的一種雙股線性DNA 病毒。該病毒顆粒的外形呈圓形或者橢圓形，外覆囊膜，并且在囊膜表面具有放射狀排列的8～10 nm 長的纖突結(jié)構(gòu)，病毒粒子的直徑在110～150 nm 之間。該病毒對外界環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，可在液體當(dāng)中或者物體表面存活7 d 以上，在pH 為4～9 的環(huán)境當(dāng)中，仍然可以維持比較穩(wěn)定的形態(tài)，病毒粒子耐熱，但經(jīng)紫外線照射后會快速失活，使用甲醛或者一些脂溶性的消毒制劑均可令其快速失活，可使用濃度為0.5%～1%的氫氧化鈉溶液消毒，能夠?qū)⑵溆行缁?。該病毒分布廣泛，在世界范圍內(nèi)均有豬偽狂犬病毒感染發(fā)生，常見的豬、牛、貓、犬等動物均對其敏感，同時對水貂也具有一定的致病性[1]。

1.2 流行特點(diǎn)

該病毒會引發(fā)豬偽狂犬病毒病，患病豬只和隱性帶毒豬是本病的主要傳染源，健康易感豬只若接觸到這些傳染源則非常容易發(fā)生感染。該病毒主要是經(jīng)過破損的皮膚、消化道和呼吸道等途徑進(jìn)入到易感豬只的體內(nèi)，特別是以空氣傳播為主。此外，母豬的乳汁、種公豬的精液以及帶毒豬只的分泌物均可傳播此病毒。

1.3 病毒基因組多樣性

豬偽狂犬病毒的基因組大小在150 kb 左右，能夠編碼70～100種病毒蛋白，但該病毒屬于DNA 病毒，整個基因組比較穩(wěn)定，雖然流行范圍非常廣泛，但僅有一種血清型。目前在全世界范圍內(nèi)分離的豬偽狂犬病毒只有g(shù)enotype Ⅰ和genotype Ⅱ型2 個基因型，并且在不同的毒株之間，致病能力和毒力也存在著很大的不同。

2 豬偽狂犬對養(yǎng)豬業(yè)的危害

如果養(yǎng)殖場沒有做好相關(guān)的疫病防控措施，則非常容易誘發(fā)場內(nèi)豬只的感染，嚴(yán)重威脅到生豬的健康發(fā)育和生產(chǎn)性能，給養(yǎng)殖者帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

2.1 對種豬的危害

臨床發(fā)現(xiàn)，種公豬感染豬偽狂犬病后，會導(dǎo)致精液帶毒，在交配過程中即可傳播給母豬。若母豬感染本病，則會對其胎盤造成嚴(yán)重的危害，還可直接侵入子宮內(nèi)誘發(fā)胎兒感染，導(dǎo)致胎兒早夭；如果是妊娠早期的母豬感染本病，則母豬子宮內(nèi)的胚胎會被吸收掉，導(dǎo)致母豬出現(xiàn)假懷孕的情況，影響母豬正常的返情率；母豬若是在妊娠中期發(fā)生感染，則會出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎等情況。此外，還可能導(dǎo)致種豬永久的喪失配種能力。

2.2 對生長育肥豬的危害

如果是在正常的飼養(yǎng)階段的育肥豬發(fā)生感染，則會誘發(fā)患豬咳嗽、呼吸困難等現(xiàn)象，還可能增加繼發(fā)豬肺疫和豬副嗜血桿菌病的幾率，導(dǎo)致患病豬只生長發(fā)育緩慢，嚴(yán)重的還可能停止生長，成為僵豬，嚴(yán)重影響飼養(yǎng)效率，造成經(jīng)濟(jì)損失。

2.3 對斷奶仔豬的危害

斷奶仔豬感染本病后，主要表現(xiàn)為腹瀉、食欲降低和高熱等臨床癥狀，但由于個體差異，有些患豬還可能出現(xiàn)眼球外翻、咳嗽、呼吸急促和角弓反張等情況，嚴(yán)重影響其正常的生長發(fā)育。

2.4 對哺乳仔豬的危害

該病毒還可以通過乳汁和尿液等途徑傳播，引發(fā)較強(qiáng)的感染性，通常來說4 周齡以下的哺乳仔豬自身免疫能力較差，非常容易受到病原微生物的侵襲，出現(xiàn)食欲廢絕、高熱以及呼吸困難等情況，隨著病情的進(jìn)一步發(fā)展，還會表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀，最終引起死亡。

3 豬偽狂犬病毒的分離鑒定

3.1 病毒的分離培養(yǎng)

無菌條件下采集病死患豬的肺、腦等組織器官的樣本，并將其進(jìn)一步搗碎、勻漿處理，隨后可根據(jù)說明書加入適量的Hank's 平衡鹽溶液，混合均勻后制備成為混懸液，離心后取上清液，無菌條件下微孔濾膜過濾，同時加入適量的鏈霉素或者青霉素等抗生素，避免被其他細(xì)菌污染，然后將最終的混合物放在-40 ℃的環(huán)境中保存。吸取含有上述病料的混懸液1 mL，接種在生長狀態(tài)良好的PK-15 細(xì)胞的細(xì)胞瓶當(dāng)中，同時設(shè)置陰性對照組，將兩組培養(yǎng)基同時置于37 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)1 h 左右，隨后再添加10 mL 左右的細(xì)胞維持液，再進(jìn)行48 h 的培養(yǎng)后，觀察其生長狀態(tài)。經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞發(fā)生病變的時間穩(wěn)定后，方可停止傳代，將該培養(yǎng)物在-40 ℃的環(huán)境當(dāng)中進(jìn)行保存[2]。

3.2 病毒的鑒定

1）中和試驗(yàn)。將樣本血清進(jìn)行連續(xù)的倍比稀釋，然后與病毒毒株進(jìn)行1:1 的混勻，在37 ℃的環(huán)境中靜置1 h 左右，隨后在96 孔板當(dāng)中進(jìn)行豬腎繼代細(xì)胞或者雞胚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)，將上述血清病毒的混合物接種到培養(yǎng)的細(xì)胞當(dāng)中，在37 ℃，含有5%的CO2的環(huán)境中靜置培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的病變程度，同時對照說明書，判斷血清的中和效價，若數(shù)值≥0.5，則可判定為陽性，否則為陰性。但這種檢測方法工作量比較大，并且操作較為復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞和技術(shù)等條件對檢測結(jié)果的影響比較大，也在一定程度上制約了該檢測方法的實(shí)際應(yīng)用。

2）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。該檢測方法是世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）推薦，血清學(xué)診斷致病原的首要方法，也是當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室檢測當(dāng)中應(yīng)用最為廣泛的一種檢測方法。這種檢測方法具有較高的敏感性，并且特異性較強(qiáng)，操作也較為簡單，能夠快速、準(zhǔn)確的檢測出樣品結(jié)果，同時還適合對大批量的樣品進(jìn)行檢測。隨著我國生物科學(xué)的不斷發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)了比較成熟的檢測方法，例如gEELISA 和gE-LAT 等，均具有較高的敏感性，同時還能夠?qū)ψ匀桓腥静《镜呢i只與疫苗免疫的豬只進(jìn)行區(qū)分，適用于豬偽狂犬病的臨床診斷。

3）間接免疫熒光技術(shù)（IFA）。該方法適用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對特定病原進(jìn)行診斷，主要是應(yīng)用了抗原與抗體能夠進(jìn)行特異性結(jié)合的特點(diǎn)，將已知的抗體與病原相結(jié)合，充分混合后，將沒有進(jìn)行結(jié)合的抗體使用洗滌液洗去，再利用熒光標(biāo)記好的抗體，與這些抗體結(jié)合，最后觀察結(jié)果時需要用到熒光顯微鏡，若抗原和抗體發(fā)生了特異性結(jié)合反應(yīng)，則可以觀察到熒光現(xiàn)象，如果沒有結(jié)合，則無法觀察到熒光現(xiàn)象。該方法既可以檢測病原的存在，也可以用于檢測致病原在特定的組織或者細(xì)胞中的分布，靈敏性與特異性較強(qiáng)。

4）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。隨著多種針對PRV 核酸檢測技術(shù)的研發(fā)與應(yīng)用，通過將特定的核酸片段指數(shù)擴(kuò)增后，可以更加精確、特異的鑒定出目標(biāo)片段是否存在。當(dāng)前使用較多的是實(shí)時定量PCR（RT-PCR）、多重PCR 以及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）等檢測技術(shù)。在對豬偽狂犬病的臨床檢測中，多使用多重PCR 技術(shù)，這種檢測方法操作簡單、敏感性較高，檢測速度也比較快，同時還可與其他病毒進(jìn)行有效區(qū)分，也可以對混合感染的患豬進(jìn)行檢測。而實(shí)時定量PCR 則具有快速、敏感等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時定量檢測，還可以同時對大量樣本進(jìn)行檢測。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增則是一種新興的檢測技術(shù)，比較適用于樣品的現(xiàn)場檢測，適用范圍更加廣泛，在反應(yīng)速度方面更有優(yōu)勢，相較于傳統(tǒng)PCR，具有更高的靈敏度與特異性[3]。

5）核酸探針技術(shù)。該方法是一種常用的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，主要通過分子雜交等手段，將基因組的DNA 進(jìn)行標(biāo)記，同時以重組質(zhì)量作為探針，將致病原進(jìn)行特異性的鑒定、檢測。或者使用基因芯片，制備得到相應(yīng)的基因芯片，可獲得更高的靈敏度，同時可將質(zhì)量好的芯片留作重復(fù)使用。該檢測技術(shù)的特異性非常高，能夠?qū)崿F(xiàn)將豬細(xì)小、豬偽狂犬等病毒進(jìn)行同時檢驗(yàn)、區(qū)分，也可以對基因缺失苗和野生毒株進(jìn)行有效區(qū)分，該檢測方法具有較好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)語

豬偽狂犬病是豬養(yǎng)殖業(yè)當(dāng)中一種常見的急性傳染性疫病，可對患病豬只的正常生長發(fā)育造成較大的負(fù)面影響，甚至危害到豬只的生命健康，造成較高的死亡率，給養(yǎng)殖者帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本病的傳播范圍廣泛，并且呈現(xiàn)一定的散發(fā)趨勢，若養(yǎng)殖場內(nèi)發(fā)現(xiàn)相關(guān)病例出現(xiàn)，則往往難以徹底將該病毒清除，需要將陽性感染的豬只全部淘汰才能徹底阻斷本病毒的傳播，否則很容易在養(yǎng)殖場內(nèi)發(fā)生反復(fù)性感染，造成重大損失。為了對本病進(jìn)行有效防控，需加大對養(yǎng)殖場內(nèi)病毒流行情況的監(jiān)測，及時淘汰帶毒的豬只，加強(qiáng)養(yǎng)殖場的清潔、消毒管理制度，積極開展相應(yīng)的防護(hù)措施，促進(jìn)生豬養(yǎng)殖業(yè)的健康快速發(fā)展?！?/p>