心肌肌鈣蛋白I檢測(cè)結(jié)果假陰性病例報(bào)道并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)

劉路遙,袁文濤,江 波,任書(shū)文,何成山

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,上海 200137

心肌肌鈣蛋白I(cTnI)在心肌損傷時(shí)可迅速釋放至外周循環(huán)中,cTnI因其心臟特異性好,靈敏度高,檢測(cè)窗口期長(zhǎng),已成為臨床上診斷心肌損傷的首選血清學(xué)標(biāo)志物[1]。cTnI的臨床檢測(cè)基于夾心抗體免疫法,檢測(cè)/捕獲抗體與cTnI不同抗原表位相結(jié)合,通過(guò)檢測(cè)抗體上酶標(biāo)基團(tuán)的化學(xué)發(fā)光信號(hào),計(jì)算cTnI水平[2]。近年來(lái)隨著免疫檢測(cè)和單克隆抗體技術(shù)的提升,溶血、黃疸、脂血、抗凝劑等分析前因素的影響已變得微乎其微[3],相對(duì)而言一些內(nèi)源性自身抗體對(duì)免疫學(xué)檢測(cè)的干擾作用更加令人關(guān)注[4-5]。本研究報(bào)道了1例因免疫性心肌肌鈣蛋白I自身抗體(cTnIAAb)導(dǎo)致cTnI與其他心肌損傷標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果嚴(yán)重不相符的臨床案例,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 病例資料

1.1一般資料 患者,女,76歲,主訴右下肢隱痛3 d,加重1 d。入院查體:右下肢膝關(guān)節(jié)以下皮膚青紫,活動(dòng)受限。輔助檢查:(1)右下肢血管超聲。右側(cè)股總動(dòng)脈、股深動(dòng)脈、股淺動(dòng)脈、腘動(dòng)脈栓塞,右側(cè)下肢深靜脈血流通暢。(2)CT檢查。主動(dòng)脈粥樣硬化,心臟增大,心包少量積液,下側(cè)雙肢動(dòng)脈粥樣硬化,右側(cè)股動(dòng)脈和腘動(dòng)脈節(jié)段性閉塞。(3)心電圖檢查。心房顫動(dòng),左室高電壓,T波V4、V5、V6倒置,Q-T間期延長(zhǎng)。(4)心臟超聲檢查。全心擴(kuò)大,室間隔增厚,二尖瓣,主動(dòng)脈瓣輕度反流。(5)實(shí)驗(yàn)室檢查。cTnI 0.023 ng/mL(正常參考值<0.026 ng/mL),肌酸激酶同工酶(CM-MB)113 ng/mL(正常參考值<5 ng/mL),肌紅蛋白(MYO)648 ng/mL(正常參考值0～106 ng/mL),B型鈉尿肽(BNP)282 pg/mL(正常參考值10～100 pg/mL),乳酸脫氫酶(LDH)273 U/L(正常參考值125～220 U/L),肌酸激酶(CK)1 241 U/L(正常參考值50～310 U/L)。入院診斷:右下肢動(dòng)脈栓塞,主動(dòng)脈及雙下肢動(dòng)脈硬化,心房顫動(dòng),高血壓。

1.2病例分析 患者年齡較大,全身性疾病較多,心電圖顯示心律失常,心房纖顫,形成的血栓經(jīng)血液循環(huán)造成下肢動(dòng)脈急性栓塞。心臟超聲檢查顯示全心增大,室間隔增厚,BNP水平大幅度升高,提示患者出現(xiàn)較為嚴(yán)重的心力衰竭表現(xiàn)。左室高電壓,T波V4、V5、V6倒置,提示心肌出現(xiàn)缺血性改變。心肌損傷標(biāo)志物CK、CM-MB、MYO水平均大幅度升高,但cTnI為0.023 ng/mL(正常參考值<0.026 ng/mL)提示檢測(cè)結(jié)果正常。患者心律失常,心功能較差導(dǎo)致代償性全心增大,心肌長(zhǎng)期缺血,產(chǎn)生心肌損傷,造成心肌損傷的血清學(xué)標(biāo)志物水平顯著升高,而cTnI的檢測(cè)結(jié)果卻未見(jiàn)明顯異常。對(duì)這一異常現(xiàn)象進(jìn)行分析,筆者猜想cTnI檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)了假陰性。

1.3cTnI檢測(cè)異常結(jié)果的分析

1.3.1cTnI檢驗(yàn)結(jié)果復(fù)檢 自檢Abbott Architect i2000全自動(dòng)免疫分析儀狀態(tài)和室內(nèi)質(zhì)控,確認(rèn)無(wú)誤后對(duì)該樣本進(jìn)行復(fù)測(cè),復(fù)測(cè)結(jié)果cTnI為0.025 ng/mL,與原結(jié)果基本一致。為了驗(yàn)證是否為檢測(cè)系統(tǒng)的因素,筆者另使用Roche Cobas e602和Sunlant SLP-001檢測(cè)系統(tǒng)及相關(guān)配套試劑對(duì)樣本的cTnI水平進(jìn)行復(fù)測(cè),檢測(cè)結(jié)果均顯示為陰性。鑒于3種不同cTnI檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)于此患者血清樣本的cTnI檢測(cè)結(jié)果均為陰性,筆者考慮是否為一種內(nèi)源性自身抗體干擾了cTnI的免疫學(xué)檢測(cè),造成cTnI的檢測(cè)結(jié)果異常。

1.3.2檢測(cè)抗核抗體譜免疫球蛋白G(IgG)水平 采用Sunlant公司抗核抗體譜IgG檢測(cè)試劑盒,檢測(cè)該血清樣本的抗核抗體,結(jié)果顯示:Ro-52、SS-A/Ro、PO、線粒體抗體(M2)、組蛋白、雙鏈DNA(dsDNA)、Jo-1、核小體、nRNP/Sm、Sm、PM-Scl、類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)為陰性,SSB(30.68 RU/mL)、Scl-70(34.53 RU/mL)、CENPB(451.29 RU/mL)呈弱陽(yáng)性(以上各項(xiàng)參考值≤20.00 RU/mL),提示該患者可能存在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、彌漫性系統(tǒng)性硬化等一系列自身免疫性疾病,但病程記錄中未見(jiàn)。基于患者存在自身免疫性疾病,外周循環(huán)中含有多種自身免疫性抗體,證實(shí)了筆者的猜想,可能是某種內(nèi)源性的自身抗體干擾了cTnI的檢測(cè)造成假陰性結(jié)果,最有可能的為cTnIAAb。

1.3.3采用前期自建的一種基于蛋白芯片的cTnIAAb檢測(cè)方法,以天然cTnI-肌鈣蛋白C(TnC)和TnC為抗原,辣根過(guò)氧化物酶-鼠抗人IgG作為二抗[6],檢測(cè)該樣本血清cTnIAAb。結(jié)果顯示cTnI-TnC列光圈明亮飽滿,檢測(cè)信號(hào)值達(dá)8 004.1 AU/mL,而TnC列僅為405.3 AU/mL,提示該患者血清樣本cTnIAAb強(qiáng)陽(yáng)性,見(jiàn)圖1。

注：第1～3列點(diǎn)樣順序:鼠源性1-IRP抗體、cTnI-TnC、TnC。

1.3.4cTnIAAb對(duì)cTnI檢測(cè)的影響 為了明確該患者血清樣本中的cTnIAAb對(duì)cTnI檢測(cè)的負(fù)性干擾程度,筆者在cTnIAAb陽(yáng)性和陰性基質(zhì)血清樣本(cTnI和cTnIAAb均為陰性)中加入一定體積終水平為200 ng/mL cTnI-TnC的天然抗原,置于37 ℃水浴箱孵育30 min后經(jīng)Architect i2000全自動(dòng)免疫分析儀上機(jī)測(cè)定,cTnI測(cè)定值分為cTnI回收濃度和理論濃度,并計(jì)算cTnI回收率,cTnI回收率=(cTnI回收濃度-基礎(chǔ)cTnI值)/cTnI理論濃度(因樣本基礎(chǔ)cTnI<0.026 ng/mL可忽略不計(jì))。結(jié)果顯示加入0.25 μL、0.50 μL、1.00 μL、1.50 μL、2.00 μL、2.50 μL 200 ng/mL的cTnI-TnC天然抗原后,cTnIAAb陽(yáng)性樣本中cTnI回收率分別為19.37%、25.36%、32.18%、40.78%、53.28%、68.15%,cTnI回收率隨著加入cTnI-TnC抗原量的增多而升高,呈正相關(guān),具有良好的線性關(guān)系(R2=0.98,P=0.001),見(jiàn)圖2。

注：cTnIAAb陽(yáng)性患者血清的cTnI回收率,Y=20.73×X+13.03,R2=0.98。

2 文獻(xiàn)復(fù)習(xí)

以“cTnI免疫學(xué)檢測(cè)干擾”和“cTnIAAb”為關(guān)鍵詞對(duì)知網(wǎng)和SCI數(shù)據(jù)庫(kù)從1995年至2023年發(fā)表的文獻(xiàn)進(jìn)行檢索。共檢索到文獻(xiàn)35篇,排除15篇,最終保留文獻(xiàn)20篇。結(jié)合病歷分析和文獻(xiàn)復(fù)習(xí),本文主要從臨床上干擾cTnI免疫檢測(cè)的角度出發(fā),重點(diǎn)敘述cTnIAAb的研究進(jìn)展,總結(jié)cTnIAAb干擾cTnI免疫檢測(cè)的成因和機(jī)制等研究現(xiàn)狀。

2.1cTnIAAb的研究進(jìn)展 外周循環(huán)中的cTnI抗原會(huì)促進(jìn)機(jī)體的自身免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性的cTnIAAb[7]。1996年BOHNER等[8]首次在1例接受冠狀動(dòng)脈旁路手術(shù)的患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種可與cTnI結(jié)合的IgG,造成該患者cTnI檢測(cè)結(jié)果正常而其他心肌損傷血清標(biāo)志物水平大幅度上升,后續(xù)ERIKSSON等[9]研究證實(shí)了該IgG為造成cTnI檢測(cè)結(jié)果異常的主要原因,并首次提出了cTnIAAb的概念。cTnIAAb廣泛存在于缺血性心肌病、擴(kuò)張性心肌病等心肌類(lèi)疾病中[10-11],cTnIAAb與心肌損傷后的持續(xù)性炎癥反應(yīng)、心臟功能受損、心室重構(gòu)和心力衰竭等密切相關(guān)[12-14]。

2.2cTnIAAb干擾cTnI免疫檢測(cè)機(jī)制 在cTnI的免疫學(xué)檢測(cè)中,肽鏈的N端(a.a.r 1-30)和C端(a.a.r 30-110)抗原氨基酸殘基易被蛋白酶水解,中心穩(wěn)定區(qū)域(a.a.r 30-110)的氨基酸受TnC的保護(hù)[15],由于其化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定被廣泛作為特異性cTnI檢測(cè)抗體位點(diǎn),在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)即使針對(duì)中心穩(wěn)定區(qū)域設(shè)計(jì)的特異性檢測(cè)抗體依然會(huì)受到多種因素的干擾,其中最主要的就是cTnIAAb[16-17]。cTnIAAb可被特異性的cTnI捕獲或檢測(cè)抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合循環(huán)中的cTnI抗原,造成cTnI檢測(cè)結(jié)果失真[18]。有研究顯示,cTnIAAb與cTnI肽鏈的a.a.r 65-74、83-93、86-90、104-119、117-126和130-145抗原表位相結(jié)合[16],這些抗原表位主要位于cTnI肽鏈的中心穩(wěn)定區(qū)域并向羧基端延伸,其中受cTnIAAb嚴(yán)重影響的中心穩(wěn)定區(qū)域與大部分商業(yè)化cTnI試劑盒的捕獲/檢測(cè)抗體結(jié)合位點(diǎn)相似,這也證實(shí)了大部分cTnI檢測(cè)試劑都無(wú)法擺脫cTnIAAb干擾的原因。

3 討 論

本研究中患者心功能不全,全心代償性增大伴嚴(yán)重心力衰竭,心肌存在長(zhǎng)期缺血性損傷,cTnI持續(xù)釋放至外周循環(huán)中。基于患者存在自身免疫性疾病史,長(zhǎng)期微量的cTnI抗原會(huì)促進(jìn)機(jī)體的自身免疫系統(tǒng)產(chǎn)生cTnIAAb。血清cTnI檢測(cè)結(jié)果為陰性,其他心肌損傷標(biāo)志物如:CK、CM-MB、MYO水平均大幅度升高,結(jié)合臨床資料筆者猜想cTnI異常檢測(cè)結(jié)果可能是cTnIAAb造成的。筆者首先使用原檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)樣本cTnI進(jìn)行了復(fù)檢,又采用了Roche和Sanlant兩種不同cTnI檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行cTnI復(fù)測(cè),結(jié)果均為陰性。不同cTnI檢測(cè)系統(tǒng)中針對(duì)cTnI抗原設(shè)計(jì)的特異性抗體的抗原表位存在一定的差異,基于國(guó)際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)公布的全球知名的cTnI檢測(cè)系統(tǒng)特異性抗體抗原表位(檢測(cè)/捕獲抗體)[19],其中Abbott Architect cTnI(a.a.r 24-41,a.a.r 86-91,a.a.r 42-49);Roche cobas e601/602 cTnI(a.a.r 86-91,a.a.r 22-44),筆者猜想可能是由于樣本中的cTnIAAb封閉cTnI上述區(qū)段的抗原表位,使得檢測(cè)/捕獲抗體無(wú)法結(jié)合cTnI,造成cTnI檢測(cè)結(jié)果呈假陰性。

血液中的cTnI存在形式復(fù)雜,單體cTnI易被蛋白酶水解,大部分以cTnI-TnC復(fù)合物的形式存在[20]。因此筆者模擬cTnI在外周循環(huán)中的主要存在形式,采用cTnI-TnC天然抗原點(diǎn)樣芯片,自建了一種全新的cTnIAAb檢測(cè)方法[1],結(jié)果顯示該患者血清cTnIAAb為強(qiáng)陽(yáng)性,證實(shí)了筆者的猜想。為進(jìn)一步研究cTnIAAb對(duì)cTnI檢測(cè)系統(tǒng)的負(fù)性干擾程度,筆者將cTnI-TnC抗原加入cTnIAAb陽(yáng)性患者血清和cTnIAAb陰性介質(zhì)血清中,進(jìn)行cTnI回收實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示cTnIAAb陽(yáng)性血清中加入2.5 μL的200 ng/mL cTnI-TnC天然抗原后,cTnI回收率為19.37%,即使加入2.5 μL的200 ng/mL cTnI-TnC天然抗原時(shí),cTnI回收率也僅為68.15%。cTnI回收率隨著加入cTnI-TnC天然抗原量的增多而增加,呈正相關(guān),具有良好的線性關(guān)系(R2=0.98,P=0.001),研究結(jié)果證實(shí)該樣本血清中的cTnIAAb可嚴(yán)重干擾Architect i2000對(duì)cTnI的檢測(cè),導(dǎo)致cTnI檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性,產(chǎn)生cTnI結(jié)果與其他心肌損傷標(biāo)志物嚴(yán)重不相符的現(xiàn)象。

綜上所述,cTnIAAb可與cTnI特異性抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合cTnI抗原表位,從而導(dǎo)致cTnI檢測(cè)結(jié)果嚴(yán)重失真,產(chǎn)生cTnI結(jié)果與心肌損傷標(biāo)志物嚴(yán)重不符的現(xiàn)象。以上提示在臨床工作中遇到此類(lèi)現(xiàn)象時(shí),應(yīng)當(dāng)首先自檢當(dāng)日質(zhì)控及儀器狀態(tài)以保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,積極與臨床醫(yī)生溝通了解患者的臨床表征與cTnI檢測(cè)結(jié)果是否相符,共同尋找cTnI檢測(cè)結(jié)果異常的原因。