妊娠合并系統性紅斑狼瘡患者血清miR-21的相對表達水平及臨床意義

何小琴,劉玢含,王 英△

1.四川大學華西醫院風濕免疫科,四川成都 610041;2.四川大學華西護理學院,四川成都 610041

系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種典型的自身免疫性疾病,其特點是產生自身抗體、沉積免疫復合物而帶來多器官功能損害[1]。SLE的臨床表現具有異質性,涉及血液、腎臟、神經等系統,使得治療和管理變得困難和復雜[2]。目前,SLE的診斷主要基于一系列臨床表現和實驗室指標,如皮膚紅斑、關節痛、補體C3、補體C4和抗雙鏈DNA抗體等[3]。由于目前SLE評估方法的復雜性、滯后性和侵襲性,研究人員正在尋找新的遺傳生物標志物,以期開發更簡單、快速和客觀的指標,更準確地預測SLE患者的病情轉歸和臨床結局[2]。

SLE好發于育齡期女性群體,可引起多種不良妊娠結局,如流產、宮內死胎與胎兒發育阻滯等,但經過病情評估、孕前診斷、免疫治療等措施,妊娠結局可得到改善[4]。因此,尋找能更方便、準確地反映妊娠合并SLE(pSLE)患者疾病活動的指標將為病情控制和妊娠結局改善提供幫助。外泌體可由各種類型的細胞分泌至細胞外并進入循環,其包含的微小RNA(miRNA)可調節受體細胞的基因表達,在細胞間通訊中發揮重要作用,產生局部旁分泌或遠端效應,也被認為是重要的生物標志物[5-6]。有研究報道,miRNA在SLE病程發展及早期診斷中具有重要作用[7-8]。本研究采用實時定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測pSLE患者血清miRNA(miR)-21的表達水平,將患者其他血液指標與miR-21水平進行相關分析,旨在探究miR-21與pSLE患者病情活動的關系及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 通過電子病例系統,選取四川大學華西醫院(以下簡稱本院)2021年6月至2023年6月診斷為pSLE的48例患者,將其納入pSLE組。納入標準:(1)符合2019年歐洲風濕病聯盟與美國風濕病學會關于SLE的分類診斷標準[9];(2)妊娠3～8個月;(3)處于疾病活躍期;(4)入院前未采用其他藥物治療;(5)臨床和實驗室檢查資料完整。排除標準:(1)合并其他慢性疾病;(2)合并其他自身免疫性疾病;(3)其他原因造成器官損害;(4)合并妊娠高血壓或妊娠糖尿病。采用SLE疾病活動指數(SLEDAI)-2000對SLEDAI進行評價,根據SLEDAI評分將pSLE組患者分為低活動組(SLEDAI評分為1～9分)和高活動組(SLEDAI評分>9分)。另選取同時期于本院體檢的30例健康妊娠期女性作為健康對照組。pSLE組與健康對照組的年齡、體質量指數(BMI)、孕次、文化程度和收入水平比較,差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性,見表1。本研究獲得患者知情同意及本院醫學倫理委員會審批通過[23年審(1405)號] 。

1.2方法

1.2.1外泌體及RNA提取 使用美國MCE血清外泌體分離試劑盒分離血清外泌體:抽取所有研究對象清晨空腹靜脈血5 mL,將血清置于4 ℃環境下,以3 000×g離心10 min后取上清液,重復2次。取1 mL離心后的上清液,加入3 mL預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS),再加入1 mL BPS,渦旋,并在4 ℃環境中靜置2 h,再以10 000×g離心 60 min,棄上清液,向沉淀物中加入0.5 mL PBS并充分重懸。重懸后的液體以12 000×g 離心2 min后收集上清液,轉移至外泌體分離柱中,再以3 000×g 離心10 min并收集柱管底部液體,得到純化的外泌體。采用天根生化miRcute miRNA提取分離試劑盒進行外泌體提取。根據產品說明書,提取血清外泌體中的miRNA,離心后收集吸附柱底的miRNA,再置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2實時熒光定量PCR檢測 采用天根生化miRcute增強型miRNA互補DNA(cDNA)第1鏈合成試劑盒,按照說明書將提取的miRNA反轉錄為cDNA,反轉錄條件為:42 ℃,60 min;95 ℃,3 min。采用天根生化miRcute增強型miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒,按照產品說明書進行實時熒光定量PCR檢測。miR-21正向引物序列為5′-GGGTAGCTTATCAGACTGATGTT-3′,反向引物序列為5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6內參正向引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應參數為95 ℃,15 min;60 ℃,34 s;94 ℃,20 s。共進行40個循環。

1.2.3其他臨床指標檢測 紅細胞沉降率(ESR)采用由意大利Vital Monitor-100全自動ESR儀檢測。CRP、補體C3和補體C4分別采用美國Biovision人CRP 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、美國ThermoFisher人補體C3 ELISA試劑盒和美國ThermoFisher人補體 C4 ELISA試劑盒按照產品說明書進行檢測。采用上海信裕生物人抗心磷脂-免疫球蛋白(Ig)A抗體(ACA-IgA)ELISA試劑盒,按照說明書對血清ACA水平進行檢測。采用廣州奧瑞達生物血清循環免疫復合物(CIC)ELISA試劑盒檢測CIC水平。

1.2.4器官損害判斷 以尿蛋白>0.5 g/24 h為腎臟受損標準;以2個以上關節疼痛并出現炎癥反應體征(壓痛、腫脹、滲出)為關節受損標準;以潰瘍、壞疽、有觸痛的手指小結節、甲周微血管病變、裂片形出血或經活檢、血管造影證實的血管炎為血管損害標準。統計并比較合并與未合并器官損害pSLE患者的miR-21相對表達水平。

2 結 果

2.1不同組別miR-21相對表達水平比較 低活動組pSLE患者有22例,高活動組pSLE患者有26例,pSLE組miR-21相對表達水平高于健康對照組(1.193±0.181vs.0.913±0.079),差異有統計學意義(t=7.995,P<0.05)。高活動組pSLE患者miR-21相對表達水平高于低活動組(1.258±0.172vs.1.117±0.164),差異有統計學意義(t=2.890,P=0.006)。

2.2健康對照組、高活動組和低活動組其他臨床檢測指標水平比較 健康對照組、高活動組和低活動組ESR、CRP、補體C3、補體C4、ACA、CIC水平比較,差異均有統計學意義(P<0.05)。高活動組和低活動組患者ESR、CRP水平顯著高于健康對照組,且高活動組顯著高于低活動組,差異均有統計學意義(P<0.05);高活動組和低活動組補體C3、C4水平低于健康對照組,且高活動組低于低活動組,差異均有統計學意義(P<0.05);高活動組患者血清ACA和CIC水平顯著高于低活動組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 健康對照組、高活動組和低活動組其他臨床檢測指標水平比較

2.3合并與未合并器官損害pSLE患者的miR-21相對表達水平比較 有腎臟和關節損害的pSLE患者的miR-21相對表達水平高于無損害患者,差異有統計學意義(P<0.05);合并和未合并血管損害的pSLE患者miR-21相對表達水平比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 合并與未合并器官損害pSLE患者的miR-21相對表達水平比較

2.4pSLE患者miR-21相對表達水平與ESR和CRP的相關性分析 Pearson相關分析結果顯示,pSLE患者miR-21相對表達水平與ESR、CRP水平呈正相關(r=0.286、0.389,P<0.05),見圖1。

注：A表示ESR與miR-21的相關性;B表示CRP與miR-21的相關性。

2.5pSLE患者miR-21相對表達水平與血清免疫學指標的相關性分析 Pearson相關分析結果顯示,pSLE患者miR-21相對表達水平與補體C3、C4水平呈負相關(r=-0.346、-0.330,P<0.05),與血清ACA、CIC水平呈正相關(r=0.499、0.326,P<0.05),見圖2。

注：A表示補體C3與miR-21的相關性;B表示補體C4與miR-21的相關性;C表示ACA與miR-21的相關性;D表示CIC與miR-21的相關性。

2.6miR-21對pSLE的診斷效能 ROC曲線分析結果顯示,miR-21診斷pSLE的曲線下面積(AUC)為0.945(95%CI:0.902～0.989)。當miR-21最佳截斷值為1.023時,診斷pSLE的靈敏度為85.4%,特異度為94.0%,見圖3。

圖3 miR-21診斷pSLE的ROC曲線

3 討 論

SLE可發生于所有年齡段的女性,尤其好發于育齡女性[4]。SLE本身并不降低女性的生育率,但會對妊娠結局產生影響,可造成母體靜脈血栓栓塞及腎損傷,以及流產、早產和胎兒發育阻滯等后果[10]。另一方面,有研究對pSLE患者相關臨床指標進行檢測發現,通過藥物治療或提前分娩等方式可在很大程度上改善妊娠結局[11]。因此,如何精準預測患者的病情成為目前治療pSLE的一大問題。本研究結果顯示,高活動組和低活動組血清miR-21相對表達水平均高于健康對照組,且高活動組高于低活動組,差異均有統計學意義(P<0.05)。ESR與CRP是高靈敏的炎癥標志物,在pSLE患者中水平升高;補體C3、C4在炎癥與免疫應答中發揮重要作用,在pSLE患者中水平下降[12-13]。本研究結果顯示,pSLE患者血清miR-21相對表達水平與炎癥反應指標ESR和CRP、免疫反應指標ACA、CIC呈正相關(P<0.05),與補體C3、C4呈負相關(P<0.05)。ROC曲線分析結果顯示,血清miR-21診斷pSLE具有較高的靈敏度及特異度。并且,合并腎臟和關節損傷的pSLE患者血清miR-21相對表達水平比未合并腎臟及關節損害的患者高。這些結果表明,血清miR-21的相對表達水平與pSLE患者的疾病活動度和器官累及程度相關,miR-21是評估pSLE患者病情的新的潛在生物標志物。

miRNA已被證實在SLE進展中發揮了重要作用。多種miRNA在SLE患者免疫細胞中表達上調或下調,并參與了T淋巴細胞和B淋巴細胞的異?；罨痆14]。例如,miR-7可促進SLE患者B淋巴細胞向漿細胞分化,miR-21則引起T淋巴細胞過度活化[15-16]。miRNA表達譜的改變與SLE病情的進展高度相關[7,16]。并且,miRNA表達水平還與SLE相關器官損害程度相關,包括狼瘡性腎炎、動脈粥樣硬化和心血管損害[17]。因此,血清miRNA可成為評估SLE病情的潛在生物標志物。例如,miR505-3p在SLE患者血漿中表達水平升高并與SLEDAI評分呈正相關,是輔助診斷SLE的潛在生物標志物[18]。但miRNA在評估pSLE患者的診斷效能的報道較少。另一方面,血液中裸露的miRNA在RNA酶的作用下往往快速降解,使其直接分離,導致檢測血清miRNA的靈敏度和特異度較低。

外泌體是一種直徑介于30～150 nm的球形脂質囊泡,其內包含蛋白質和miRNA等生物活性物質,廣泛參與多種疾病的發展過程,并因其可進入血液循環而成為潛在的理想監測靶標。外泌體已被證明在SLE疾病進展中發揮了重要作用[19]?，F有證據表明,循環外泌體的水平與SLE的疾病活動顯著相關[20]。人體尿液、血清和唾液中的細胞外miRNA多數集中在外泌體中,使得它們在脂質雙分子層的保護下不被RNA酶降解[7]。miRNA不僅在SLE發展中發揮了重要作用,還是一種診斷pSLE的潛在生物標志物[7]。因此,分離純化并檢測體液中的miRNA相對表達水平,是評估pSLE病情進展的一種高靈敏手段。

已有證據表明,血清miRNA含有多種疾病的指紋圖譜,并能夠將SLE從其他炎癥疾病中辨別出來,使得體液中miRNA成為潛在診斷SLE的生物標志物,另外,miR-21在SLE患者中呈高水平表達并與SLEDAI評分呈正相關,在活躍和非活躍SLE患者中呈現出表達差異,在病情緩解患者血液中表達下降[21]。最新的研究顯示,抑制miR-21相對表達水平可顯著改善狼瘡表型,包括皮膚損害和狼瘡性腎炎[22]。這些結果使得miR-21成為預測SLE疾病進展的一項潛在生物標志物,但其在pSLE患者中的表達和作用前期報道較少。

本研究結果顯示,血清miR-21可較好地用于評估pSLE患者臨床疾病活動和器官損害,并對pSLE患者具有較高的診斷靈敏度和特異度。因此,血清miR-21可作為評估pSLE患者病情的潛在生物標志物,有助于更精確地評估和預測病情進展,為及時采取措施改善病情和妊娠結局提供依據。