磁微粒化學發光法測定VEGF的性能驗證和臨床應用效果評估

屠競揚,周 琰,邵文琦△,潘柏申,王蓓麗,郭 瑋,2,3,4

1.復旦大學附屬中山醫院檢驗科,上海 200032;2.上海市老年醫學中心檢驗科,上海 201104;3.上海市寶山區吳淞中心醫院檢驗科,上海 200940;4.復旦大學附屬中山醫院廈門醫院檢驗科,福建廈門 361015

近年來,肺癌、結直腸癌、胰腺癌、胃癌等惡性腫瘤的發病率和病死率呈逐年上升趨勢,這對于人們的身心健康和生活質量產生了巨大的影響。很多惡性腫瘤患者由于初期癥狀不明顯,而耽誤了最佳治療時機。因此,臨床需要更多的早期腫瘤標志物對于各種惡性腫瘤患者進行早期篩查。血管內皮生長因子(VEGF)是一種相對分子質量為34～46×103的高度糖基化的二聚體可溶性堿性糖蛋白,具有很強的促進血管內皮細胞分裂、繁殖及增強毛細血管通透性的能力,并且在許多病理生理過程中都有表達。在眾多血管生成因子當中,VEGF是公認的主要誘導血管生成的物質,是腫瘤血管生成的最有效的刺激因子,與腫瘤的發生、發展具有密切的關系。VEGF雖作為一種新型腫瘤標志物備受臨床關注,但目前國內對惡性腫瘤患者血清VEGF水平的檢測尚處于初級階段,臨床普及率仍較低。使用磁微?；瘜W發光法檢測VEGF水平相較于目前臨床上常用的直接化學發光法,其能通過磁場分離出VEGF,使檢測的準確率更高。本研究擬對VEGF測定試劑盒(磁微粒化學發光法)做性能分析和初步臨床應用效果評估。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2023年8月于復旦大學附屬中山醫院(以下簡稱本院)確診為實體惡性腫瘤患者80例作為癌癥組,其中肺部、結直腸、胰腺、胃部腫瘤患者各20例,良性病變患者80例作為良性疾病組,其中肺部、結直腸、胰腺、胃部疾病患者各20例。癌癥組及良性疾病組入組排除并發風濕、類風濕關節炎、心肌梗死及其他心臟疾病、血管炎、系統性紅斑狼瘡、嚴重感染及嚴重內科疾病的患者。另選取于本院體檢的表觀健康者20例作為健康對照組。健康對照組平均(40.90±12.14)歲,良性疾病組平均(56.25±13.44)歲,癌癥組平均(61.59±12.69)歲,3組年齡比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究獲得本院醫學倫理委員會審核批準(B2018-099),所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2樣本采集與檢測 采用黃頭采血管(含促凝劑惰性分離膠)采集所有研究對象靜脈血5 mL,室溫靜置30 min,再置于4 ℃環境下以 1 007×g離心10 min,分離血清后置于-20 ℃冰箱中保存待測。排除有明顯溶血、脂血、黃疸的樣本。檢測儀器為Aurora-1000i全自動化學發光免疫分析儀,購自山東康華生物醫療科技股份有限公司。VEGF測定試劑盒內含試劑1、試劑2及配套校準品和質控品。

1.3方法學評價

1.3.4線性范圍驗證 選用VEGF低濃度(L)樣本(40 pg/mL)和高濃度(H)樣本(3 200 pg/mL)各1份,1份取2 mL,并按5H、4H∶1L、3H∶2L、2H∶3L、1H∶4L、5L的比例混合成6個10 mL的混合樣本,編號分別為L6、L5、L4、L3、L2、L1,每個濃度樣本重復檢測2次。根據CNAS-GL037文件[2]規定,以實測值為Y,理論測定值為X,擬合線性回歸方程Y=a×X+b,線性相關系數r≥0.99為符合要求。

1.3.6參考范圍驗證 廠家聲明的VEGF參考范圍為<160 pg/mL。本實驗室抽取20例表觀健康人群。根據WS/T 402-2012:《臨床實驗室檢驗項目參考區間的制定》[3]中小樣本驗證的規定,所選取的20例樣本落在參考限外的測定值不超過兩個,可認為引用的參考區間適合本實驗室。

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1.3.7干擾驗證 選取低值樣本(VEGF水平為145 pg/mL)和高值樣本(VEGF水平為1 000 pg/mL),各取200 μL,分別加入10 μL干擾物質(30 mg/mL甘油三酯、2 mg/mL血紅蛋白、350 μmol/L膽紅素)為實驗組,空白樣本為對照組。同時測定對照組和實驗組VEGF水平,依據產品說明書,加入干擾物質后低值樣本陰陽性不變,高值樣本測值偏差在15%以內為符合要求。

1.4臨床評估 分別檢測癌癥組、良性疾病組、健康對照組VEGF水平,統計分析3組間水平差異,評估臨床應用效果。

2 結 果

2.1重復性驗證 低值樣本重復檢測20次的結果為(133.381±5.849)pg/mL,CV為4.38%;高值樣本重復檢測20次的結果為(972.146±12.868)pg/mL,CV為1.32%,均滿足目標CV(≤6.25%),重復性驗證通過。見表1。

表1 重復性驗證結果

2.2中間精密度驗證 低值樣本測量10次的結果為(128.914±3.062)pg/mL,CV為2.38%;高值樣本測量10次的結果為(960.202±18.142)pg/mL,CV為1.92%。均滿足目標CV(≤8.33%)?？膳袛嘀虚g精密度驗證通過。見表2。

表2 中間精密度驗證結果(pg/mL)

表3 正確度驗證結果(pg/mL)

圖1 線性相關分析圖

表4 線性范圍驗證(pg/mL)

2.5可報告范圍驗證 稀釋比為1.0∶5.0樣本的偏差為-3.17%,是偏差絕對值<12.5%的樣本中稀釋倍數最大的,因此,VEGF測定試劑盒的最大可信稀釋比為1.0∶5.0,可報告范圍為40～16 000 pg/mL。見表5。

表5 不同稀釋比下可報告范圍驗證

2.7干擾驗證 干擾驗證后,低值樣本的VEGF水平均仍呈陰性結果(<160 pg/mL),膽紅素、血紅蛋白、甘油三酯干擾物高值實驗組的偏差分別為5.34%、2.59%、3.08%,小于產品說明書聲明的15.0%,對檢測結果未產生影響,干擾驗證通過。見表6。

表6 在不同干擾物干擾下VEGF的測定結果(pg/mL)

圖2 VEGF診斷惡性腫瘤的ROC曲線

3 討 論

VEGF是一種具有血管通透性的同型二聚體糖蛋白[4],在調控血管形成和發育中起關鍵作用[5]。人類VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F、胎盤生長因子(PLGF)及內分泌腺衍生的VEGF (EG-VEGF)。臨床上通常所說的VEGF往往指VEGF-A,其在新生血管生成中發揮重要作用,可引起細胞增殖、抑制細胞凋亡、血管通透性增加、血管舒張、炎癥細胞向損傷部位募集等[6]。而惡性腫瘤不斷進展,生長到超出預先存在的脈管系統范圍的器官組織,就會誘導新生血管形成以促進其進一步發生、發展。因此,血管異常被認為是惡性腫瘤的標志之一[7]。已有部分研究顯示血清VEGF可作為惡性腫瘤的診斷和預測預后的指標[8-9],乳腺癌[10]、宮頸癌[11]、原發性肝癌[12]等惡性腫瘤患者均有VEGF水平升高的現象。

目前對于VEGF的檢測一般采用酶聯免疫吸附實驗、熒光層析法、化學發光法等,但這些方法都存在一定不足,如檢測時間長、靈敏度低等問題。 本研究采用磁微?；瘜W發光法檢測VEGF水平,將雙抗體夾心法免疫測定原理與超順磁性納米微球標記技術和化學發光免疫分析相結合,定量檢測人血清樣本中的VEGF水平。結果顯示,磁微?；瘜W發光法檢測血清VEGF的重復性、中間精密度、正確度、線性范圍、可報告范圍、參考區間、干擾物質影響下準確度均通過了驗證。

已有部分研究證明,血清VEGF診斷肺鱗癌[13]、結直腸癌[14]的靈敏度較高。本研究結果顯示,相比于良性病變患者及健康人群,惡性腫瘤患者血清VEGF水平顯著升高,VEGF診斷惡性腫瘤的靈敏度為0.69,特異度為0.95,AUC為0.90,提示血清VEGF對于惡性腫瘤有著較高的篩查價值。CHIN等[15]在2003年就提出血清VEGF水平升高是結直腸癌患者術后復發的獨立危險因素,并且TKACZ等[16]也提出在惡性腫瘤早期,VEGF水平在患者血清中升高。本研究結果也發現,癌癥組患者VEGF水平顯著高于健康對照組和良性疾病組(P<0.05),這初步提示可以將血清VEGF作為診斷惡性腫瘤的輔助指標,結合患者影像學及其他腫瘤標志物,將有助于進一步提高診斷惡性腫瘤的特異度和靈敏度。

本研究也存在一定局限性。(1)入組樣本數較少,尚需進一步入組更多臨床樣本,探討VEGF在惡性腫瘤鑒別診斷中的價值;(2)未收集患者隨訪數據,在后續研究中筆者將補充癌癥組臨床資料,評價VEGF在預測疾病預后中的價值。

綜上所述,本研究所采用的磁微粒化學發光法檢測VEGF水平不僅成本低、操作簡單,且靈敏度高、穩定性好,適合臨床常規工作,對于協助惡性腫瘤的診斷有一定價值。