透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3 表達(dá)及其與臨床病理特征、免疫浸潤的關(guān)系

馮 歡 何昊瑋

東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院泌尿外科，江蘇南京 210000

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是最常見的一類腎臟異質(zhì)性惡性腫瘤，透明細(xì)胞RCC（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）為RCC 的主要亞型，占70%～80%[1-2]。全身治療是晚期ccRCC 患者的主要治療方法[3]。然而，由于ccRCC 對傳統(tǒng)化療和放療具有耐藥性，需要進一步研究驅(qū)動ccRCC 起始和進展的分子機制，實現(xiàn)對這種異質(zhì)性腫瘤的個體化醫(yī)療[4]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在多種癌癥的生長中起著重要作用，是JAK-STAT 信號通路的核心成分，其表達(dá)激活與病理進展和總體生存率差有關(guān)[5-6]。靶向STAT3 被認(rèn)為是治療腫瘤的合適措施[7]。早期的研究表明，抑制STAT3 信號傳導(dǎo)可以有效降低ccRCC 細(xì)胞在體內(nèi)和體外的增殖活性[8-9]。然而，STAT3 抑制是否能直接誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞的免疫原性死亡及其潛在的分子機制尚不清楚。本研究利用組織微陣列（tissue microarray，TMA）對ccRCC 中STAT3 的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系進行分析，并進一步通過數(shù)據(jù)庫信息探討STAT3 與免疫浸潤的相關(guān)性，為STAT3 靶點藥物的研發(fā)提供一定的醫(yī)學(xué)證據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017 年3 月至2022 年1 月東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院泌尿外科手術(shù)切除的105 例ccRCC 患者的癌組織及43 例癌旁組織（距離腫瘤組織≥3 cm），其中男77例，女28 例；年齡30～87 歲，中位年齡60 歲。創(chuàng)建TMA 并進行免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）染色分析，回顧性分析患者臨床和病理信息（包括年齡、性別、腫瘤大小、Fuhrman 分級、T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2022 版歐洲泌尿外科學(xué)會腎癌診療指南中的ccRCC 診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；②接受根治性或部分腎切除術(shù)治療，術(shù)后癌組織經(jīng)病理檢查證實為ccRCC 組織；③臨床病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②肝、腎功能嚴(yán)重異常；③術(shù)前接受放化療等腫瘤治療；④患有嚴(yán)重感染。該研究獲得了東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)（YL2022-0103）。

1.2 TMA 及IHC 分析

由105 個ccRCC 和43 個癌旁正常腎臟石蠟包埋樣本構(gòu)建TMA，先用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）對每個樣本的一個切片（4 μm）進行染色，并對代表性區(qū)域的選擇進行審查。對每個樣品使用半自動組織芯片（加拿大CHEMICO International）獲得3 個直徑為1 mm 的代表性區(qū)域，將組織以間隔排列模式進行石蠟包埋，使用EnVisionTM+Dual Link System-HRP（DAB+）試劑盒（美國Dako，貨號#K4065）用于IHC 分析。所用一級抗體STAT3（美國abcam，ab194307）以1∶100比例稀釋對載玻片進行染色，并使用二氨基聯(lián)苯胺（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZLI-9017）進行顯色。染色由2 名對疾病結(jié)果不知情的腎臟病理學(xué)專家獨立進行評估。根據(jù)STAT3 的染色強度（0～3分）和頻率（0～4 分）進行評分，按STAT3 的表達(dá)水平將其分為STAT3 高表達(dá)（≥2 分）和STAT3 低表達(dá)患者（＜2 分）[11]。

1.3 TIMER 數(shù)據(jù)庫分析

TIMER 數(shù)據(jù)庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer）用于探索STAT3 基因表達(dá)與ccRCC 的免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)聯(lián)，以評估TCGA 中腫瘤浸潤免疫細(xì)胞（tumor infiltrating immune cell，TIIC）的豐度。選擇基因模塊來分析ccRCC 隊列（n=533）中STAT3 與6 個TIIC亞群（即B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）之間的關(guān)系，選擇純度調(diào)整后的樣品。

1.4 TISIDB 數(shù)據(jù)庫分析

TISDB 數(shù)據(jù)庫（http://cis.hku.hk/TISIDB）含有包括TCGA 在內(nèi)的多個公共數(shù)據(jù)庫，選擇淋巴細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)器模塊（n=534）來研究STAT3 基因表達(dá)與ccRCC 中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）和免疫抑制劑豐度之間的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗；計數(shù)資料采用例數(shù)和百分率表示，比較采用χ2檢驗。采用偏相關(guān)系數(shù)（partial correlation coefficient,PCC）和Spearman 相關(guān)系數(shù)分析相關(guān)性。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ccRCC 癌組織及癌旁組織STAT3 的TMA-IHC結(jié)果

TMA-IHC 分析顯示，STAT3 陽性信號分布于大多數(shù)鄰近的非腫瘤腎小管上皮細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞漿中，105 例ccRCC 癌組織中，共有53 例（50.48%）STAT3蛋白呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率高于癌旁腎臟組織（32.56%，14/43），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.953，P=0.046）。HE 染色顯示，免疫細(xì)胞零星分散在ccRCC 組織中，提示ccRCC 組織中豐富的免疫浸潤。見圖1。

圖1 ccRCC 癌組織及癌旁組織STAT3 的TMA-IHC 結(jié)果

2.2 ccRCC 組織STAT3 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

STAT3 表達(dá)與ccRCC 患者腫瘤大小、Fuhrman 分級、T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)（P＜0.05）。見表1。

表1 ccRCC 組織STAT3 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.3 TIMER、TISIB 數(shù)據(jù)庫分析

TIMER 數(shù)據(jù)庫分析顯示，STAT3 表達(dá)與B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的浸潤水平呈正相關(guān)（PCC＞0，P＜0.05）。TISIDB 數(shù)據(jù)庫分析顯示，STAT3 表達(dá)自然殺傷細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞豐度呈正相關(guān)（rs＞0，P＜0.05），并且與CD56bright、CD56dim自然殺傷細(xì)胞豐度呈負(fù)相關(guān)（rs＜0，P＜0.05）。見圖2～3。

圖2 ccRCC 患者STAT3 表達(dá)與腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的相關(guān)性

圖3 ccRCC 患者STAT3 表達(dá)與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的相關(guān)性

3 討論

作為一種眾所周知的異質(zhì)性疾病，RCC 仍然缺乏有助于個體化治療選擇和預(yù)后預(yù)測的生物標(biāo)志物[1-2]。因此，臨床迫切需要研究與ccRCC 發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子標(biāo)志物，以更好地了解該疾病的發(fā)病機制，從而實現(xiàn)個體化醫(yī)療和改善臨床結(jié)局。STAT3 是STAT 家族的重要成員，目前被認(rèn)為是一種致癌基因，其異常調(diào)控已在近70%的癌癥中被報道[12-13]。STAT3 通過參與細(xì)胞的侵襲、遷移、轉(zhuǎn)移和血管生成，促進細(xì)胞繁殖和惡性轉(zhuǎn)化，通過多種途徑阻礙細(xì)胞凋亡，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。癌細(xì)胞中STAT3 的異常激活導(dǎo)致細(xì)胞生長因子和抗凋亡分子的持續(xù)轉(zhuǎn)錄，這些因子和抗凋亡分子在維持細(xì)胞生長和存活中起著至關(guān)重要的作用[14-16]。例如STAT3 已被發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌和胃癌中持續(xù)激活，在乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多種腫瘤中異常表達(dá)[17-23]。此外，已有研究證實STAT3 可促進ccRCC細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，在ccRCC 中發(fā)揮原癌性作用[24]。本研究采用TMA-IHC 法檢測STAT3 在ccRCC癌組織及癌旁正常組織中表達(dá)，結(jié)果顯示STAT3 在癌組織中高表達(dá)患者占比高于癌旁組織中高表達(dá)患者，與既往研究結(jié)果一致，提示STAT3 參與了ccRCC發(fā)生過程[24]。

STAT3 在惡性腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤分化程度或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[25]。既往研究發(fā)現(xiàn)，STAT3 在子宮內(nèi)膜癌中的陽性表達(dá)與子宮肌層浸潤深度及腫瘤分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[22]。為進一步研究STAT3 表達(dá)與ccRCC 臨床病理特征的相關(guān)性，本研究比較不同STAT3 表達(dá)水平ccRCC 患者臨床病理特征差異，結(jié)果顯示，STAT3 表達(dá)水平與ccRCC 患者的腫瘤大小、Fuhrman 分級、T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，提示STAT3 促進了ccRCC 侵襲、轉(zhuǎn)移過程。這可能歸因于STAT3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的雙重功能，STAT3 通過促進腫瘤細(xì)胞生長增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及免疫逃逸，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但其在ccRCC 中的具體機制有待進一步研究予以證實[26-27]。

此外，本研究結(jié)果還顯示，STAT3 與腫瘤免疫浸潤有關(guān)。腫瘤微環(huán)境中的免疫浸潤不僅與癌癥患者的預(yù)后有關(guān)，而且具有很大的癌癥治療潛力。研究表明，一些免疫浸潤細(xì)胞，包括調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，對RCC 進展有很大影響[28-29]。在本研究中，HE 染色結(jié)果顯示，免疫細(xì)胞零星分散在ccRCC 組織中，提示ccRCC 組織中豐富的免疫浸潤。此外，本研究使用TIMER、TISIDB 數(shù)據(jù)庫進一步評估了STAT3 與ccRCC 中免疫特征之間的關(guān)系。TIMER分析顯示，STAT3 表達(dá)與所有6 種TIIC 亞群的浸潤水平呈正相關(guān)，包括B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。TISIDB 分析結(jié)果顯示，STAT3 表達(dá)與大量TIL 的豐度顯著相關(guān)，包括自然殺傷細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞，并且與CD56bright和CD56dim自然殺傷細(xì)胞的豐度呈負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果顯示，STAT3 表達(dá)升高會影響免疫細(xì)胞浸潤，提示STAT3 對調(diào)節(jié)ccRCC 中的腫瘤免疫浸潤具有重要意義，可能作為免疫治療的潛在靶點。

綜上，STAT3 高表達(dá)與ccRCC 臨床病理特征較差有關(guān)；此外，STAT3 與腫瘤免疫浸潤顯著相關(guān)，對于控制免疫細(xì)胞浸潤很重要，可能是一種有價值的預(yù)后生物標(biāo)志物。但本研究仍具有一定局限性，例如樣本量較小，需要更多的臨床樣本分析研究來驗證上述發(fā)現(xiàn)。此外，為了對STAT3 如何影響ccRCC 免疫浸潤的精確過程提供更多信息，需要進行進一步的體內(nèi)或體外實驗。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。