右美托咪定對IL-1β誘導的人髓核細胞凋亡和炎癥反應的影響

王磊，吳海龍，張金強

中國人民解放軍火箭軍特色醫學中心麻醉科，北京 102209

椎間盤退變是慢性腰痛的常見原因，主要原因為髓核長期慢性勞損、反復外力刺激，導致髓核水分流失嚴重，進而出現變性改變，臨床表現為腰背部或頸部疼痛、感覺異常及活動障礙等［1］。椎間盤受損后易引起形態學改變，有研究顯示，炎性微環境改變是椎間盤疼痛的主要原因，而白細胞介素1β（IL-1β）誘導的髓核細胞損傷是其主要病理特征，進而介導椎間盤髓核細胞再生、衰老、凋亡和炎癥反應等過程，加速疾病進展［2-3］。右美托咪定（Dex）是臨床常用的麻醉藥，具有鎮靜鎮痛、抑制術后應激反應等作用，現階段主要用于麻醉誘導、急危重癥鎮痛、減少術后躁動等［4］。有研究發現，Dex通過調節磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶通路可減輕IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡、外基質降解和炎癥損傷［5］。但有關Dex 對IL-1β 誘導的髓核細胞損傷的影響尚不清楚。2021 年10 月—2022 年11 月本研究通過建立體外細胞模型模擬椎間盤退變，以探究Dex 對IL-1β誘導的髓核細胞凋亡和炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人髓核細胞購自武漢賽奧斯生物科技有限公司；胎牛血清、杜氏改良依格爾培養基（DMEM）培養基購自美國Gibo公司；Dex購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；外源性IL-1β 購自美國Sigma公司；噻唑藍（MTT）試劑盒、凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-8、IL-6 試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；一氧化氮（NO）試劑盒購自上?？瓢┥锟萍加邢薰?；B 細胞淋巴瘤/白血病2（Bcl-2）抗體、誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）抗體、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）抗體、環氧化酶2（COX-2）抗體購自英國Abcam 公司；二喹啉甲酸（BCA）試劑盒、電化學發光（ECL）試劑購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 細胞培養 將人髓核細胞于恒溫水浴鍋中解凍，復蘇后，將細胞加至含有10% 胎牛血清的DMEM 培養基中，于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養；細胞生長融合至90%，加胰酶消化傳代培養；取第3～5代細胞進行實驗。

1.3 細胞分組及干預 將生長良好的髓核細胞隨機分為對照組（Control 組）、IL-1β 組、IL-1β+Dex-L組、IL-1β+Dex-M 組、IL-1β+Dex-H 組。Control 組不做任何處理，其他組依次給予10 ng/mL IL-1β、10 ng/mL IL-1β+25 nmol/L Dex、10 ng/mL IL-1β+50 nmol/L Dex、10 ng/mL IL-1β+100 nmol/L Dex，繼續培養24 h。

1.4 細胞存活率檢測 采用MTT 法。收集各組細胞并將其接種96孔板中，每孔100 μL，培養24、48 h，加MTT 試劑20 μL，繼續培養4 h，棄培養液，加150 μL 的二甲基亞砜試劑，結晶完全溶解后，用酶標儀檢測波長490 nm 處的吸光度值（OD 值），細胞存活率=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.5 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術。收集各組細胞，用預冷緩沖液洗滌細胞，并調整至1×105/mL。取100 μL細胞懸液，加磷脂結合蛋白V FITC和碘化丙啶各5 μL，避光孵育15 min，繼續加400 μL 細胞懸液，上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，細胞凋亡率（%）=（早期凋亡數+晚期凋亡數）/細胞總數×100%。

1.6 TNF-α、IL-8、NO、IL-6 檢測 采用酶聯免疫吸附法。取各組細胞，4 ℃下4 000 r/min 離心8 min（離心半徑12 cm）后取細胞上清液，按照試劑盒操作說明檢測TNF-α、IL-8、NO、IL-6因子表達。

1.7 Bcl-2、Bax、iNOS、COX-2 蛋白檢測 采用Western blotting 法。檢測收集各組細胞，用蛋白裂解液提取總蛋白，經BCA 法檢測定量后，將50 μg上樣蛋白通過電泳分離后轉移至硝酸纖維素膜上，加5%脫脂奶粉封閉培養120 min，與Bcl-2、Bax、iNOS、COX-2 一抗在4℃下過夜孵育，次日與辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗室溫孵育120 min。最后加ECL 試劑顯影，ImageJ 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.8 統計學分析 采用SPSS26.0 統計軟件。服從正態分布計量資料以-x±s表示，多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較行LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Dex 對IL-1β 誘導后髓核細胞存活率的影響 見表1。

表1 各組培養不同時間細胞存活率比較（%，-x ± s）

2.2 Dex 對IL-1β 誘導后髓核細胞凋亡的影響 見表2。

表2 各組細胞凋亡率及凋亡相關蛋白表達比較（-x ± s）

2.3 Dex 對IL-1β 誘導后髓核細胞炎癥反應的影響 見表3。

表3 各組細胞上清液中炎癥因子水平比較（pg/mL，-x ± s）

2.4 Dex 對IL-1β 誘導后髓核細胞中COX-2、iNOS蛋白表達及上清液中NO水平的影響 見表4。

表4 各組細胞中COX-2、iNOS蛋白表達及上清液中NO水平比較（-x ± s）

3 討論

研究顯示，約40%椎間盤退變患者會出現下腰痛，而10%患者長期處于殘疾狀態。椎間盤主要由中間凝膠狀的髓核細胞及包繞周圍的11～15層同心纖維層組成，通過軟骨終板與上下椎體相互連接，三者之間共同構成人體脊柱的基本緩沖和承重單元［6-7］。當椎間盤發生退變時，可引起椎間盤髓核細胞中釋放大量炎癥因子，如IL-1β、TNF-α、IL-8 等［8］，激烈炎癥反應可誘導髓核細胞合成能力減弱，促進細胞凋亡，導致髓核細胞過度病變，最終加速椎間盤退變［9-10］。髓核細胞含有豐富蛋白多糖、水分和Ⅱ型膠原，其保水能力對抵抗脊柱壓縮軸向力至關重要，并維持椎間盤正常高度。已有研究證明，髓核細胞代謝失衡、凋亡和炎癥反應等與椎間盤退變密切相關［11］。IL-1β是生物體常見細胞因子，幾乎所有核細胞中都能合成IL-1β，其主要來源于活化的單核巨噬細胞和淋巴細胞等，其在免疫調節、炎性反應、化合物代謝調節等方面發揮重要作用，若機體內IL-1β出現失衡，可誘導多種病理生理變化，如膿毒癥、關節炎、椎間盤退變等炎性疾?。?2-14］。本研究用多功能因子IL-1β處理髓核細胞以建立椎間盤退變體外模型，且多數研究已證明該細胞模型可成功模擬椎間盤退變［15-16］。本研究顯示，IL-1β可減弱細胞存活，并加速細胞凋亡，這與楊利斌等［16］研究報道一致，證明模型構建成功。

Dex 屬于高效選擇性受體激動劑，具有多種功效，除鎮靜、鎮痛作用外，還具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用［17］。YOSHIKAWA 等［18］報道稱，Dex 還可通過激活膽堿能的抗炎通路，促進單核巨噬細胞中炎癥因子合成，進而抑制全身炎癥反應。近年Dex因具有細胞保護作用被廣泛關注，其對心臟、腎臟、肝臟及腦等具有保護作用［19］。于芝等［20］在膝骨關節炎中研究發現，Dex 可減輕炎癥誘導的人軟骨細胞自噬和凋亡。邢丹丹等［21］通過體內動物實驗發現，Dex 介導炎癥經典信號通路，進而抑制佐劑性膝骨關節炎細胞滑膜樣凋亡。但其對椎間盤退變的實驗研究還不清楚。本研究發現，采用不同濃度Dex 處理IL-1β 誘導的髓核細胞后，可呈濃度依賴性升高細胞存活率，并降低細胞凋亡率、Bax 蛋白表達，上調Bcl-2蛋白表達。表明Dex 可減輕IL-1β 誘導的髓核細胞凋亡，促進細胞增殖。

研究顯示，炎癥因子改變與椎間盤退變發展具有重要臨床意義，當椎間盤發生病變時，可促進髓核細胞釋放較多TNF-α、IL-6 等因子［22］。本研究證實，IL-1β 處理髓核細胞可促進大量炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8 表達，可見，在椎間盤退變過程中，炎癥反應中細胞因子增加是其必經過程。持續神經根和脊髓壓迫，可激活iNOS產生大量NO，進一步加重受傷區域中iNOS 表達，誘導髓核細胞過度凋亡，加重椎間盤退化［23］。COX-2 是一種炎癥反應介質，是炎癥因子較為重要的一種，COX-2 可催化生成前列腺素含量，進而減少蛋白多糖含量，以促進椎間盤退變［24］。本研究發現，IL-1β 誘導的髓核細胞可上調COX-2、iNOS蛋白表達，并促進NO合成，經Dex干預后，可降低COX-2、iNOS 蛋白表達，減少NO 合成及TNF-α、IL-6、IL-8 釋放，提示Dex 可減輕IL-1β 誘導的髓核細胞炎癥反應。

綜上所述，Dex 可抑制IL-1β 誘導的髓核細胞凋亡和炎癥反應，并促進細胞增殖，有助于延緩椎間盤退變疾病進展。但本研究側重于體外細胞模型研究，下一步可通過建立椎間盤退變大鼠模型，體內觀察Dex 對椎間盤退變大鼠髓核細胞損傷的影響，以驗證本結論。