安羅替尼通過NF-κB信號通路對腦膠質瘤細胞增殖、凋亡的影響

柳新，謝云鵬，張圣林，李青山，董怡

1 承德醫學院附屬醫院腫瘤科，河北 承德 067000；2 承德醫學院附屬醫院神經外科

腦膠質瘤是常見的顱內腫瘤之一，具有惡性程度高、發展速度快的特點［1］。目前臨床上治療腦膠質瘤通常以手術切除為主，放化療為輔。但腦膠質瘤患者在發現時多為中晚期，錯過最佳手術治療時機，而放化療易出現毒副反應。因此亟需尋找更有效的治療藥物。安羅替尼是一種口服多靶點酪氨酸激酶抑制劑，對血管內皮生長因子受體（VEGFR）、成纖維細胞生長因子受體（FGFR）和血小板衍生生長因子受體（PDGFR）等激酶有抑制作用，可通過抑制與癌細胞增殖和轉移相關信號通路，多靶點實現對癌細胞的抑制作用［2-3］。核因子κB（NF-κB）是哺乳動物體中一種極為重要的轉錄因子，NF-κB 信號通路參與調控多種與炎癥反應、機體免疫、凋亡、細胞分化相關的基因表達［4-5］。阻斷NF-κB 信號通路能夠預防和逆轉腫瘤細胞耐藥、增殖、凋亡等惡性行為［6］。但目前關于安羅替尼通過NF-κB 信號通路與腦膠質瘤之間的關系尚未清晰。2022年2月—2023年2月，本研究將對此展開探討，旨在為腦膠質瘤的基礎研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦膠質瘤細胞（T98G 細胞）購自上海中科院細胞庫。安羅替尼和NF-κB 通路抑制劑BAY 11-7082 購于上海碧云天生物技術有限公司，CCK-8 試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司，5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（EdU）細胞增殖檢測試劑盒和Hoechst33258 染色液均購于生工生物工程（上海）股份有限公司，鼠抗人細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（NF-κB p65）及β-actin 單克隆抗體購于武漢三鷹生物技術有限公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 及山羊抗鼠IgG 多克隆抗體購于英國Abcam 公司。DYCZ-24KF 型四板垂直蛋白電泳儀購于北京六一生物科技有限公司，DM IL LED 熒光顯微鏡購于德國徠卡公司，THZ-98A 型二氧化碳培養箱購于上海博迅實業有限公司，FluorChem HD2 型凝膠成像系統購于美國Proteinsimple公司。

1.2 T98G 細胞培養 將凍存的T98G 細胞進行復蘇后（≥80%密度）接種于培養板或培養皿中，置于37 ℃、5% CO2、70%～80%濕度培養箱中，在完全培養基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM-H）中進行培養。

1.3 細胞分組與藥物干預 將T98G細胞隨機分為對照組、5 μmol/L 安羅替尼組、10 μmol/L 安羅替尼組、20 μmol/L 安羅替尼組、陽性藥物組、抑制劑組。對照組不予干預，5 μmol/L 安羅替尼組、10 μmol/L安羅替尼組、20 μmol/L 安羅替尼組分別以5、10、20 μmol/L 安羅替尼進行干預，陽性藥物組以50 mg/L 的5-氟尿嘧啶進行干預。用CCK-8 法檢測細胞活力，因10 μmol/L 安羅替尼組細胞活力接近對照組的50%，因此抑制劑組加入10 μmol/L 安羅替尼+5 μmol/L NF-κB 通路抑制劑BAY 11-7082 進行干預，每組設置3 個復孔，后置于37 ℃，5% CO2條件下進行培養。

1.4 細胞活力檢測 采用CCK-8 法。將細胞接種于96孔板中，1×104/孔。分別加藥處理24 h后，各孔加入10% CCK-8 溶液，37 ℃、5% CO2培養箱中培養2 h，用酶標儀檢測波長450 nm 處的光密度（OD450）值。細胞活力（%）=［OD（實驗組或抑制劑組或陽性藥物組）-OD空白組］/（OD對照組-OD空白組）×100%。

1.5 細胞增殖率測算 采用EdU 法。取培養24 h的各組細胞，按照EdU 試劑盒說明書操作，反應完成后裝片，并在熒光顯微鏡下拍照，用Image J 軟件處理圖片。細胞增殖率=EdU陽性染色細胞/總細胞數×100%。

1.6 細胞凋亡率測算 采用Hoechst33258染色法。取各組細胞，用PBS 將細胞洗滌2 次，每次5 min，加入4%多聚甲醛，在4 ℃條件下固定10 min。用PBS洗滌后，用 5 mg/L Hoechst33258染色液染色10 min，隨后洗滌，封片，置熒光顯微鏡下拍照。細胞凋亡特征為核體積發生濃縮變小，且染色不均勻濃染同時有較強的熒光，為亮藍色。細胞凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.7 細胞增殖、凋亡相關蛋白及NF-κB信號通路相關蛋白檢測 采用Western blotting 法。取培養24 h的各組細胞，提取蛋白并定量后上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳，200 mA 電流轉膜，封閉2 h，后加入Cyclin D1（1∶5 000）、Caspase-3（1∶2 000）、NF-κB p65（1∶2 000）、p-NF-κB p65（1∶1 000）及β-actin（1∶5 000）一抗進行孵育、洗滌、二抗孵育、洗滌，加顯影液，用凝膠成像系統進行相應的拍照記錄，并用ImageJ 軟件進行蛋白灰度分析，β-actin 為內參蛋白。目標蛋白相對表達量=目標蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.8 統計學方法 采用SPSS23.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Tukey 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞活力比較 對照組、5 μmol/L 安羅替尼組、10 μmol/L 安羅替尼組、20 μmol/L 安羅替尼組、陽性藥物組細胞活力分別為（100.00 ±9.36）%、（86.90 ± 2.59）%、（55.47 ± 3.43）%、（42.37 ± 3.75）%、（41.97 ± 2.89）%。5 μmol/L 安羅替尼組細胞活力與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與對照組比較，10、20 μmol/L 安羅替尼組、陽性藥物組細胞活力低（P均＜0.05）。10 μmol/L安羅替尼組細胞活力接近50%。

2.2 安羅替尼對T98G細胞增殖率的影響 與對照組比較，10 μmol/L安羅替尼組、20 μmol/L安羅替尼組、陽性藥物組細胞增殖率低、凋亡率高（P均＜0.05）；與陽性藥物組比較，10 μmol/L安羅替尼組細胞增殖率高、凋亡率低（P均＜0.05），20 μmol/L安羅替尼組細胞增殖率、凋亡率與陽性藥物組比較差異無統計學意義（P均＞0.05）；與10 μmol/L安羅替尼組比較，抑制劑組細胞增殖率低、凋亡率高（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組細胞增殖率、細胞凋亡率比較（%，± s）

表1 各組細胞增殖率、細胞凋亡率比較（%，± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與陽性藥物組比較，P＜0.05；與10 μmol/L安羅替尼組比較，#P＜0.05。

細胞凋亡率5.11 ± 1.18 14.33 ± 1.53*images/BZ_11_559_1087_587_1120.png27.09 ± 2.11*27.05 ± 2.65*37.33 ± 2.08#組別對照組10 μmol/L安羅替尼組20 μmol/L安羅替尼組陽性藥物組抑制劑組細胞增殖率55.93 ± 3.23 44.40 ± 4.19*images/BZ_11_559_1087_587_1120.png26.87 ± 3.68*26.47 ± 2.53*19.10 ± 2.35#

2.3 安羅替尼對T98G 細胞中Caspase-3、Cyclin D1蛋白表達的影響 與對照組比較，10 μmol/L 安羅替尼組、20 μmol/L 安羅替尼組、陽性藥物組Caspase-3 蛋白表達高，Cyclin D1 蛋白表達低（P均＜0.05）；與陽性藥物組比較，10 μmol/L 安羅替尼組Caspase-3 蛋白表達低，Cyclin D1 蛋白表達高（P均＜0.05）；20 μmol/L 安羅替尼組Caspase-3、Cyclin D1蛋白表達與陽性藥物組比較差異無統計學意義（P均＞0.05）；與10 μmol/L 安羅替尼組比較，抑制劑組Caspase-3 蛋白表達高，Cyclin D1 蛋白表達低（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組Caspase-3、Cyclin D1蛋白表達比較（± s）

表2 各組Caspase-3、Cyclin D1蛋白表達比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與陽性藥物組比較，P＜0.05；與10 μmol/L安羅替尼組比較，#P＜0.05。

Cyclin D1蛋白1.02 ± 0.08 0.86 ± 0.06*images/BZ_11_559_1087_587_1120.png0.51 ± 0.03*0.51 ± 0.04*0.12 ± 0.03#組別對照組10 μmol/L安羅替尼組20 μmol/L安羅替尼組陽性藥物組抑制劑組Caspase-3蛋白0.41 ± 0.02 0.81 ± 0.04*images/BZ_11_559_1087_587_1120.png1.23 ± 0.06*1.22 ± 0.04*2.05 ± 0.11#

2.4 安羅替尼對T98G 細胞中NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白表達的影響 與對照組比較，10 μmol/L 安羅替尼組、20 μmol/L 安羅替尼組、陽性藥物組NFκB p65 蛋白表達差異無統計學意義（P均＞0.05），p-NF-κB p65 蛋白表達低（P均＜0.05）；與陽性藥物組比較，10 μmol/L 安羅替尼組NF-κB p65 蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），p-NF-κB p65 蛋白表達高（P＜0.05）；20 μmol/L 安羅替尼組NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白與陽性藥物組比較差異無統計學意義（P均＞0.05）；與10 μmol/L安羅替尼組比較，抑制劑組NF-κB p65 蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），p-NF-κB p65蛋白表達低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達比較（± s）

表3 各組NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與陽性藥物組比較，P＜0.05；與10 μmol/L安羅替尼組比較，#P＜0.05。

p-NF-κB p65蛋白0.80 ± 0.06 0.51 ± 0.02*images/BZ_11_559_1087_587_1120.png0.37 ± 0.02*0.38 ± 0.02*0.08 ± 0.01#組別對照組10 μmol/L安羅替尼組20 μmol/L安羅替尼組陽性藥物組抑制劑組NF-κB p65蛋白1.02 ± 0.06 1.02 ± 0.08 1.02 ± 0.08 1.03 ± 0.08 1.08 ± 0.05

3 討論

與正常腦組織比較，腦膠質瘤組織因邊界不明，手術難度較高，導致腫瘤無法完全切除，極易復發，放化療又易產生較大不良反應［7］。因此，探索有效治療腦膠質瘤的藥物并明晰其相關作用機制具有非常重要的意義。安羅替尼是一種多靶點的酪氨酸酶抑制劑，具有高選擇性以及強效抑制的特點［8］。安羅替尼可以通過調控與癌細胞生長、分化相關的信號通路直接抑制癌細胞，對腫瘤血管的生成和生長有較強的抑制作用［9］。HE 等［10］研究表明，安羅替尼可抑制肝癌細胞的增殖并誘導其凋亡；安羅替尼也可誘導肺癌細胞凋亡［11］。吳廣銀等［12］研究發現，安羅替尼可誘導膠質瘤細胞凋亡。增殖與凋亡相關因子Cyclin D1 可調節細胞周期；而Caspase-3 作為一種半胱氨酸蛋白酶，與細胞的凋亡具有緊密聯系。蘇俊玲等［13］報道，Cyclin D1 蛋白可通過干擾細胞周期進而影響癌細胞增殖。本研究結果顯示，與對照組比較，10、20 μmol/L 安羅替尼組和陽性藥物組細胞活力、增殖率、Cyclin D1 蛋白表達低，凋亡率、Caspase-3 蛋白表達高；與陽性藥物組比較，10 μmol/L 安羅替尼組增殖活力、增殖率和Cyclin D1 蛋白表達高，凋亡率和Caspase-3 蛋白表達低；20 μmol/L 安羅替尼組與陽性藥物組比較細胞活力、增殖率、凋亡率、Cyclin D1和Caspase-3蛋白表達均無顯著差異。說明高濃度安羅替尼對腦膠質瘤細胞的作用與陽性藥物5-氟尿嘧啶相當，這與相關研究［14］相符。結果提示安羅替尼可抑制腦膠質瘤細胞增殖，誘導其凋亡。

NF-κB 作為對細胞基因轉錄起關鍵調節作用的因子，對腫瘤血管生成也同樣重要。NF-κB信號通路和腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡關系密切，在腫瘤發展過程中發揮重要的作用。王文忠等［15］研究表明，NF-κB信號通路能夠影響鼻咽癌細胞的惡性生物學行為。研究發現，在膠質瘤中NF-κB 信號通路出現過激活現象［16］。安羅替尼可通過降低p-NF-κB p65表達，誘導肺癌細胞凋亡，進而發揮抑癌作用［17］。在本研究中為避免細胞死亡太多干擾實驗，選取了細胞活力接近50%的10 μmol/L 安羅替尼加入NF-κB通路抑制劑BAY 11-7082 驗證NF-κB 通路的作用。結果發現，抑制劑組較10 μmol/L安羅替尼組細胞增殖率、Cyclin D1 和p-NF-κB p65 蛋白表達低，而細胞凋亡率和Caspase-3 水平較10 μmol/L 安羅替尼組高。抑制劑能夠抑制NF-κB 通路活性，但該通路并未被完全阻斷。本研究在安羅替尼基礎上加入NF-κB通路抑制劑后與單獨安羅替尼組相比，作用被進一步加強，說明安羅替尼與BAY 11-7082可能具有協同作用，提示安羅替尼可能通過抑制NF-κB 通路信號抑制人腦膠質瘤細胞增殖，并促進其凋亡。

綜上所述，安羅替尼可能通過抑制NF-κB 信號通路抑制人腦膠質瘤T98G 細胞增殖，并誘導其凋亡。但安羅替尼在腦膠質瘤中的作用是否與其他機制有關，尚需進一步深入探究。