唾液酸灌胃干預腸道微生態預防小鼠更年期抑郁癥的機制

趙平，孔令勝，季曉宇，洪波，徐藝，徐玲，張曉，陳霞，劉麗艷，常煥顯

1 徐州醫科大學附屬連云港東方醫院神經內科，江蘇 連云港 222042；2 徐州醫科大學附屬連云港東方醫院婦產科

更年期抑郁癥是臨床常見的精神心理疾病，是因精神焦慮、緊張及抑郁所導致的綜合征。該病女性發病率顯著高于男性，發病年齡45～60 歲多見。現階段隨著生活壓力的增大及人口老齡化加劇，其發病率逐漸升高。研究表明，更年期抑郁癥多與內分泌腺體功能障礙、代謝異常及植物神經紊亂相關［1］。目前，越來越多的研究表明，腸道菌群與多種疾病如糖尿病［2］、阿爾茨海默病［3］及抑郁癥［4］等的發生、發展相關。腸道菌群與情緒關系密切，如乳桿菌與雙歧桿菌均可促進積極情緒的產生，可通過改變腸道菌群而改善相關疾病［5］。唾液酸（SA）又稱N-乙酰神經氨酸，是從唾液腺體黏蛋白中分離出的一種九碳糖神經氨酸酰化物，具有多種生理功能，有抗炎、抗病毒及抗腫瘤的作用［6］。另外，SA 濃度越高乳桿菌的數量也越多，可見SA對腸道內益生菌的生長具有促進作用［7］。2022 年5 月—8 月，本研究通過建立更年期抑郁癥小鼠模型，觀察SA預防小鼠更年期抑郁癥的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級雌性C57BL/6 小鼠60只，3～4 周齡，體質量25～30 g；均購于凱學生物科技（上海）有限公司，許可證號：SYXK（滬）2022-0011；飼養于南京醫科大學康達學院動物實驗中心，環境溫度22～25 ℃，濕度40%～70%，明暗交替各12 h，自由飲水及攝食；適應環境7 d后進行實驗。所有實驗遵循國家有關實驗動物的使用、福利和倫理學要求等規定。

1.1.2 主要試劑及儀器 SA 購于中科鴻基生物科技有限公司；鹽酸氟西汀購于禮來蘇州制藥有限公司；戊巴比托鈉購于北京縱橫科技有限公司；ELISA試劑盒購于上海化邦生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購于上海遠慕生物科技有限公司；海馬組織色氨酸羥化酶2（TPH2）抗體、酪氨酸羥化酶（TH）抗體、吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）抗體、腦源性神經營養因子（BDNF）、糖酸結合免疫球蛋白樣受體11（Siglec11）抗體購于艾美捷生物科技有限公司；骨鈣素（OC）抗體、組織緊密連接帶蛋白1（ZO-1）抗體購于上海鈺博生物科技有限公司；緊密連接蛋白4（claudin4）抗體購于深圳市安提生物科技有限公司；GAPDH 兔多克隆抗體購于賽默飛世爾科技有限公司；BCA蛋白含量試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）配膠試劑盒購于上海彩佑實業有限公司；DHX-50 小動物呼吸機購于香港友誠生物科技有限公司；12008007 型臺式離心機購于金壇市大地自動化儀器廠；DYCZ-25DN 蛋白電泳儀購于北京德元國際科技有限公司。

1.2 動物分組及模型構建 將60 只小鼠按照隨機數字表法分為Sham 組、模型組、SA 低劑量組、SA 中劑量組、SA 高劑量組及鹽酸氟西汀組，各10 只。術前禁食24 h，除Sham 組外其他五組經小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg），于下腹部正中切開，摘除兩側卵巢。Sham 組不切除卵巢，僅切除卵巢周圍組織。術后7 d 檢測動情周期，如連續5 d 未見動情則說明去勢成功。去勢后參考文獻［8］建立抑郁癥動物模型，除Sham 組外均進行慢性不可預測的應激，包含電擊足底（強度5 mA，隔20 s 刺激1 次，連續刺激30 min），8 ℃下游泳5 min，鼠籠傾斜45°刺激5 min，搖晃鼠籠10 min（強度以大鼠不能站穩為準），方向不定，夾尾巴1 min，禁止飲水24 h。每天選取1 種上述刺激方法，連續刺激21 d。每周測量體質量，觀察動物體質量和攝食量變化，出現抑郁焦慮樣行為。

1.3 干預方法［9］造模成功后1～2 d，SA 低、中、高劑量組分別給予16、32、64 mg/kg 的SA 灌胃，鹽酸氟西汀組給予2 mg鹽酸氟西汀灌胃，Sham組及模型組給予等體積生理鹽水灌胃，按人和小鼠體表面積折算小鼠用藥量。每天1次，連續灌胃14 d。

1.4 行為學檢測

1.4.1 強迫游泳實驗（FST） 末次灌胃后，將小鼠放在玻璃容器（長度10 cm、寬度10 cm、高40 cm，水的深度30 cm）中，水溫20～25 ℃，水面高度以小鼠抓不到地面且頭部剛好露出水面為宜。每只小鼠測試完均換水。保持環境安靜，記錄小鼠入水6 min的錄像，統計4 min內不動時間。

1.4.2 小鼠懸尾實驗（TST） 末次灌胃后，將小鼠放在獨立的操作箱（55 cm×60 cm×11.5 cm）中，用膠帶將其尾部末端1 cm 處固定于箱內支架上，頭部距離地面約20 cm，保持環境安靜，記錄懸掛6 min 錄像，統計4 min內不動時間。測試完清理糞便。

1.5 腸壁血流灌注、血流速度檢測 行為學檢測完成后，經小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg），麻醉后將其固定在加熱墊上，刮除腹部毛發，碘酒消毒，沿腹部中線切開長度約3 cm 的切口，找到回盲部，輕拉小腸腸絆。采用高功率針式激光多普勒血流檢測儀，VP4 探頭，檢測腸壁血流灌注（血流灌注單位）、血流速度。用激光多普勒血流灌注成像儀進行腸壁血流成像分析，用mLDIVersion5.3 軟件對灌注水平進行分析。

1.6 腸道菌群檢測 采用16s rRNA 基因測序法。1.5 檢測結束后，收集小鼠新鮮糞便，-80 ℃保存。用DNA提取試劑盒提取糞便RNA，用NanoDrop1000測定DNA質量濃度，1%的瓊脂凝膠電泳檢測DNA質量。PCR擴增樣品，將引物338F、806R在V3～V4區域進行純化及定量，構建測量文庫。用Illumina-Misq高通量測序平臺進行測序，按照≥97%的相似度進行分類，得到可操作分類單元，將其中豐度最大的序列作為該單元的代表序列。按照界、門、綱、目、科、屬及種水平逐級將腸道菌群進行結構分層，得到可操作單元注釋結果后按照分類進行匯總，得到各個樣本的相對豐度，并進行菌群結構分析，計算Shannon指數。

1.7 腸組織Siglecs、OC、ZO-1、claudin4 及海馬組織TPH2、TH、IDO、BDNF 蛋白檢測 采用Western blotting 法。將各組小鼠麻醉處死，每組取100 mg 腸組織及海馬組織，加入1 mL 的裂解液及10 μL 的蛋白酶抑制劑，充分研磨，4 ℃下15 000 r/min 離心（離心半徑4.8 cm），每次20 s，間隔20 s，共離心5次。60 s后提取上清液，每個樣本取25 μL 檢測蛋白濃度。按照樣本制備溶液，用SDS-PAGE 凝膠，上樣，電泳，轉膜，將PVDF 膜從轉膜槽中取出，用TBST 漂洗5 min，加入稀釋后的Siglecs（1∶100）、OC（1∶200）、ZO-1（1∶100）、CL（1∶100）、β-actin（1∶200）一抗，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000），孵育2 h。避光環境下將顯影液加入PDCF膜，60 s后用Image-lab圖像分析系統成像并進行分析。目標蛋白相對表達量=目標蛋白光密度/內參光密度。

1.8 統計學方法 采用SPSS26.0 統計軟件、GraphPad Prism8 軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組行為學變化比較 與Sham 組比較，模型組TST、FST 的4 min 內不動時間長（P均＜0.05）；與模型組比較，SA 低、中、高劑量組及鹽酸氟西汀組TST、FST 的4 min 內不動時間短（P均＜0.05）；與低、中劑量SA 組比較，SA 高劑量組TST、FST 的4 min 內不動時間短（P均＜0.05）；SA 高劑量組TST、FST 的4 min 內不動時間與鹽酸氟西汀組比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 各組TST、FST的4 min內不動時間比較（s，± s）

表1 各組TST、FST的4 min內不動時間比較（s，± s）

注：與Sham 組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與SA 低劑量組比較，▲P＜0.05；與SA中劑量組比較，△P＜0.05。

組別Sham組模型組SA低劑量組SA中劑量組SA高劑量組鹽酸氟西汀組P n FST 77.02 ± 15.80 168.23 ± 30.18*135.11 ± 25.74#131.75 ± 24.00#100.10 ± 18.22#▲△104.37 ± 19.20#▲△＜0.05 10 10 10 10 10 10 4 min內不動時間TST 86.20 ± 12.50 147.11 ± 25.50*125.60 ± 22.70#122.30 ± 23.02#103.12 ± 20.21#▲△100.70 ± 22.40#▲△＜0.05

2.2 各組腸壁血流灌注、血流速度比較 與Sham組比較，模型組血流灌注單位、血流速度低（P均＜0.05）；與模型組比較，SA 低、中、高劑量組及鹽酸氟西汀組血流灌注單位高，中、SA 高劑量組及鹽酸氟西汀組血流速度高（P均＜0.05）；與低、中劑量SA 組比較，SA 高劑量組血流灌注單位、血流速度高（P均＜0.05）；與鹽酸氟西汀組比較，SA 高劑量組血流灌注單位、血流速度高（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組血流灌注、血流速度比較（± s）

表2 各組血流灌注、血流速度比較（± s）

注：與Sham 組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與SA 低劑量組比較，▲P＜0.05；與SA 中劑量組比較，△P＜0.05；與SA 高劑量組比較，P＜0.05。

血流速度（cm/s）1 008.20 ± 183.10 782.04 ± 126.50*815.07 ± 143.20 1 021.07 ± 154.27#1 307.06 ± 180.02#▲△1 050.08 ± 177.40#images/BZ_11_559_1087_587_1120.png＜0.05組別Sham組模型組SA低劑量組SA中劑量組SA高劑量組鹽酸氟西汀組P n 10 10 10 10 10 10血流灌注單位153.10 ± 18.05 105.20 ± 20.10*121.74 ± 23.11#133.00 ± 27.00#165.05 ± 31.11#▲△140.00 ± 28.07#images/BZ_11_559_1087_587_1120.png＜0.05

2.3 各組腸道菌群16s rRNA基因測序結果比較

2.3.1 各組腸道菌群Shannon指數比較 Sham組、模型組、SA 低劑量組、SA 中劑量組、SA 高劑量組及鹽酸氟西汀組的Shannon 指數分別為7.01 ± 0.80、9.35 ± 1.28、8.60 ± 1.25、8.52 ± 1.22、8.01 ±0.92、8.05 ± 0.89，各組比較差異有統計學意義（P均＜0.05）。與Sham 組比較，模型組Shannon 指數高（P＜0.05）；與模型組比較，SA 低、中、高劑量組及鹽酸氟西汀組Shannon指數低（P均＜0.05）；與低、中劑量SA 組比較，SA 高劑量組Shannon 指數低（P均＜0.05）；SA高劑量組Shannon指數與鹽酸氟西汀組比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。

2.3.2 各組腸道菌群相對豐度比較 與Sham 組比較，模型組糞球菌屬、小桿菌屬相對豐度低，擬桿菌門及變形桿菌門相對豐度高（P均＜0.05）；與模型組比較，SA 低、中、高劑量組及鹽酸氟西汀組糞球菌屬、小桿菌屬相對豐度高，擬桿菌門及變形桿菌門相對豐度低（P均＜0.05）；與低、中劑量SA 組比較，SA高劑量組糞球菌屬、小桿菌屬相對豐度高，擬桿菌門及變形桿菌門相對豐度低（P均＜0.05）；SA 高劑量組腸道菌群相對豐度與鹽酸氟西汀組比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。見表3。

表3 各組腸道菌群相對豐度比較（%，± s）

表3 各組腸道菌群相對豐度比較（%，± s）

注：與Sham組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與SA低劑量組比較，▲P＜0.05；與SA中劑量組比較，△P＜0.05。

組別Sham組模型組SA低劑量組SA中劑量組SA高劑量組鹽酸氟西汀組P小桿菌屬0.76 ± 0.13 0.38 ± 0.04*0.45 ± 0.10#0.47 ± 0.09#0.58 ± 0.10#▲△0.55 ± 0.11#▲△＜0.05 n 10 10 10 10 10 10糞球菌屬62.25 ± 13.02 41.30 ± 7.70*46.82 ± 13.01#48.00 ± 15.20#65.05 ± 17.38#▲△62.80 ± 19.03#▲△＜0.05擬桿菌門38.70 ± 7.32 58.05 ± 10，20*50.05 ± 11.07#49.38 ± 12.15#44.02 ± 9.03#▲△45.89 ± 9.57#▲△＜0.05變形桿菌門0.56 ± 0.06 1.93 ± 0.24*1.47 ± 0.20#1.45 ± 0.24#1.05 ± 0.17#▲△1.08 ± 0.18#▲△＜0.05

2.4 各組腸組織Siglecs、OC、ZO-1、claudin4 蛋白表達比較 與Sham 組比較，模型組Siglecs、OC、ZO-1、claudin4 蛋白表達低（P均＜0.05）；與模型組比較，SA 低、中、高劑量組及鹽酸氟西汀組Siglecs、OC、ZO-1、claudin4 蛋白表達高（P均＜0.05）；與低、中劑量SA 組比較，SA 高劑量組Siglecs、OC、ZO-1、claudin4 蛋白表達高（P均＜0.05）；SA 高劑量組Siglecs、OC、ZO-1、claudin4 蛋白表達與鹽酸氟西汀組比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。見表4。

表4 各組腸組織Siglecs、OC、ZO-1、claudin4蛋白表達比較（± s）

表4 各組腸組織Siglecs、OC、ZO-1、claudin4蛋白表達比較（± s）

注：與Sham組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與SA低劑量組比較，▲P＜0.05；與SA中劑量組比較，△P＜0.05。

組別Sham組模型組SA低劑量組SA中劑量組SA高劑量組鹽酸氟西汀組P claudin4 1.34 ± 0.17 0.60 ± 0.13*0.80 ± 0.14#0.84 ± 0.12#▲1.10 ± 0.17#▲△1.08 ± 0.20#▲△＜0.05 n 10 10 10 10 10 10 Siglecs 0.85 ± 0.11 0.29 ± 0.05*0.42 ± 0.10#0.45 ± 0.11#▲0.67 ± 0.14#▲△0.70 ± 0.16#▲△＜0.05 OC 1.20 ± 0.20 0.57 ± 0.11*0.73 ± 0.13#0.76 ± 0.15#▲1.00 ± 0.21#▲△1.04 ± 0.24#▲△＜0.05 ZO-1 0.73 ± 0.10 0.34 ± 0.07*0.42 ± 0.09#0.46 ± 0.10#▲0.62 ± 0.13#▲△0.64 ± 0.11#▲△＜0.05

2.5 各組海馬組織TPH2、TH、IDO、BDNF 蛋白表達比較 與Sham 組比較，模型組海馬組織TPH2、TH、BDNF 蛋白表達低，IDO 蛋白表達高（P均＜0.05）；與模型組比較，SA 低、中、高劑量組及鹽酸氟西汀組海馬組織TPH2、TH、BDNF 蛋白表達高，IDO蛋白表達低（P均＜0.05）；與低、中劑量SA 組比較，SA 高劑量組海馬組織TPH2、TH、BDNF 蛋白表達高，IDO 蛋白表達低（P均＜0.05）；SA 高劑量組海馬組織TPH2、TH、IDO、BDNF 蛋白表達與鹽酸氟西汀組比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。見表5。

表5 各組海馬組織TPH2、TH、IDO、BDNF蛋白表達比較（± s）

表5 各組海馬組織TPH2、TH、IDO、BDNF蛋白表達比較（± s）

注：與Sham組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與SA低劑量組比較，▲P＜0.05；與SA中劑量組比較，△P＜0.05。

組別Sham組模型組SA低劑量組SA中劑量組SA高劑量組鹽酸氟西汀組P BDNF 1.87 ± 0.29 0.83 ± 0.17*1.17 ± 0.16#1.20 ± 0.15#1.60 ± 0.27#▲△1.64 ± 0.30#▲△＜0.05 n 10 10 10 10 10 10 TPH2 1.05 ± 0.13 0.47 ± 0.08*0.60 ± 0.13#0.62 ± 0.16#0.82 ± 0.18#▲△0.90 ± 0.21#▲△＜0.05 TH 0.90 ± 0.11 0.44 ± 0.12*0.53 ± 0.14 0.56 ± 0.17#0.71 ± 0.16#▲△0.70 ± 0.19#▲△＜0.05 IDO 0.31 ± 0.07 0.85 ± 0.12*0.70 ± 0.11#0.66 ± 0.13#0.47 ± 0.10#▲△0.49 ± 0.12#▲△＜0.05

3 討論

更年期抑郁癥是以情感持續低落為主要特征的疾病。絕經前期及絕經后期由于激素水平的變化，可促進抑郁的發生。更年期抑郁癥的發病機制存在多樣性，有微生物炎癥假說、神經遞質假說等，而腸道菌群在更年期抑郁癥進展中具有重要意義。

TST 及FST 通過模擬慢性應激和絕望狀態，觀察小鼠的行為變化，如不動行為等可評估情緒狀態和心理健康狀況。在探究更年期抑郁癥的病理生理機制研究中，TST 及FST 不動時間延長，證實動物建模成功［10］。本研究結果顯示，與Sham 組比較，模型組TST 及FST 4 min 不動時間延長，而采用不同劑量SA 及鹽酸氟西汀干預后，TST 及FST 均縮短，說明SA 可顯著改善更年期抑郁癥小鼠的行為。鹽酸氟西汀是臨床常用的抗抑郁藥物，可選擇性地抑制5-羥色胺再攝取，從而提高腦內5-羥色胺水平，起到緩解抑郁癥狀的作用［11］。因此，本研究以鹽酸氟西汀作為陽性對照藥物。SA 是一種神經調節物質，與神經發育和突觸可塑性有關。近年發現，SA 在抑郁癥的發生、發展中可能起重要作用。抑郁癥患者血漿SA 水平顯著下降，與抑郁癥嚴重程度呈負相關。同時，動物研究也表明，SA 水平降低會導致抑郁樣癥狀，包括情緒低落、消極行為和社交回避等［12］。本研究給予更年期抑郁癥小鼠SA灌胃，發現不動時間縮短，證實更年期抑郁癥小鼠行為有所改善。

本研究結果顯示，與Sham 組比較，模型組腸道血流灌注單位、血流速度降低；SA 灌胃后，小鼠血流灌注單位、血流速度均升高，以SA 高劑量組變化最顯著。說明SA 可改善更年期抑郁癥小鼠腸道血流灌注及血流速度。微生物-腸-腦軸形成反饋機制共同調控機體。腸道微生物可激活腸內分泌細胞，產生5-色胺、多巴胺、去甲腎上腺素、BDNF 等。大腦通過神經-免疫-內分泌體系調控胃腸道功能；同時，腸道微生物及其代謝產物可刺激腸神經系統，從而調節腸蠕動，參與腸腦交互作用。抑郁癥患者腸道微生物改變后，主要通過迷走神經、下丘腦-垂體-腎上腺軸、下丘腦-垂體-性腺軸、免疫系統、代謝途徑調控大腦，從而影響海馬的主持情緒、情感、認知等功能，導致疾病發生［13］。本研究采用16s rRNA基因測序分析各組新鮮糞便，發現抑郁癥小鼠腸道菌群Shannon 指數升高，同時小桿菌屬、小桿菌屬豐度降低，擬桿菌門及變形桿菌門豐度升高；當采用不同劑量SA干預后可顯著改善上述現象，并推測SA 可通過改善腸道菌群微生態而提高腸道血流灌注、血流速度。研究表明，抑郁癥小鼠腸道微生態菌群的Shannon 指數升高［14］，這與本研究結果相似。但也有研究表明，與正常小鼠比較，抑郁癥小鼠腸道菌群Shannon 指數無顯著改變［15］。有研究對1 054名比利時人的腸道菌群構成進行分析，發現腸道菌群改變與抑郁癥發生具有因果關系［16］。這與本研究結果一致。研究結果顯示，SA 可阻止病原體對腸黏膜的黏附，還具有調節腸道菌群，促進免疫系統成熟的作用［17］。SA 可保護腸道黏液屏障，并調控腸道菌群穩態［18］。本研究結果顯示，SA 可通過增加腸道Siglecs 表達調節腸道菌群多樣性，并通過調節糞球菌屬和小桿菌屬豐度發揮抗抑郁作用。

Siglecs 是糖基化識別因子，主要存在于免疫細胞中，能夠識別及結合不同糖基化位點，調節腸道微生物，進一步影響宿主免疫應答［19］。OC在骨骼代謝中起重要作用，其水平下降可能與更年期抑郁癥的發生有關［20］。ZO-1和claudin4是細胞連接的重要組成部分，其異常表達可能與更年期抑郁癥的發生有關［21］。TPH2、TH 和IDO 是合成5-羥色胺的關鍵酶，TPH2 基因多態性影響疾病易感性，但TH、IDO 與TPH2 的關系尚不明確。BDNF 是具有保護神經元作用的蛋白質，可調節腦神經可塑性，同時抑郁癥與神經元可塑性降低相關［22］。研究發現，抑郁癥患者血漿BDNF水平降低，BDNF水平與抑郁癥及自殺行為有關［23］。本研究認為SA可調節腸道菌群，主要通過升高Siglecs 水平調節腸道代謝產物，如短鏈脂肪酸和神經遞質類似物質，從而影響神經傳遞及認知功能。本研究結果顯示，不同劑量SA 灌胃后，更年期抑郁癥小鼠Siglecs、OC、ZO-1、claudin4、TPH2、TH及BDNF 蛋白表達升高，IDO 蛋白表達降低，說明SA可通過調節上述指標表達而調節腸道菌群及神經炎癥。

綜上所述，SA 可治療小鼠更年期抑郁癥，其作用機制可能為一方面通過增加小鼠腸道Siglecs 表達，降低擬桿菌門及變形桿菌豐度來改善小鼠腸道微生態；另一方面通過促進BDNF分泌來營養神經。