高脂飲食誘導肥胖小鼠不同脂肪組織炎癥反應相關基因表達及其機制

陳思遠，郭子豪，萬夢瑤，梁小弟，2

1 新疆醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，烏魯木齊 830017；2 新疆地方病分子生物學重點實驗室

肥胖是一種由遺傳、環境、心理和社會因素引起的慢性代謝性疾病［1］。其最明顯的特征是體內脂肪堆積過多，當身體的能量攝入大于消耗時，機體會將多余的能量以TG的形式儲存在脂肪組織，經過長期累積會促進脂肪組織的擴張，最終導致肥胖［2］。肥胖不僅會影響形體，還會增加糖尿病、高血壓、腫瘤以及免疫失調等一系列疾病發生的風險［3］。HOTAMISLIGIL等［4］首次提出肥胖是由不同炎癥因子誘導產生的一種全身性的慢性低度炎癥狀態，脂肪組織的慢性炎癥是聯系肥胖和代謝類疾病的關鍵所在［5］。哺乳動物體內的脂肪組織根據形態和功能分為白色脂肪組織（WAT）和棕色脂肪組織（BAT）。WAT 會將多余的能量儲存起來，并分泌脂肪因子以微調代謝和炎癥反應；而BAT 則以非顫栗性產熱的方式消耗能量來維持體溫。在肥胖狀態下，WAT 會過度擴張導致脂肪細胞肥大，其中會伴隨多種炎癥因子的產生和分泌增加［6］；BAT 在炎癥的刺激下線粒體的完整性遭到破壞，并進一步導致產熱功能受損［7］。肥胖誘發的炎癥反應會對兩種脂肪組織造成不同的影響，但目前對肥胖不同組織間炎癥反應的研究較少，因此有必要探究不同脂肪間的炎癥反應機制。炎癥反應機制涉及多個基因變化以及信號通路的激活。用轉錄組學對脂肪組織進行測序分析，可更好地觀察不同脂肪組織中炎癥相關基因的表達差異。2022 年3 月—11 月，本研究構建了高脂飲食誘導的肥胖小鼠模型，并探究不同脂肪組織間的炎癥反應機制，以探討肥胖與炎癥的關系，為臨床診治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 C57BL/6J 雄性小鼠10 只，6 周齡，體質量（19 ± 1）g，購自新疆醫科大學動物實驗中心，許可證號為SCXK（新）2018-0002，均在新疆醫科大學SPF 動物實驗中心喂養，溫度（22 ± 3）°C，濕度（50 ±5）%，每天明暗時間各12 h。本實驗通過倫理審查委員會批準（IACUC-20220310-06）。高脂飼料，含脂量60% kCal，購于美國Research Diet公司。

1.2 動物分組及模型制備方法 將10 只小鼠隨機分為正常飲食對照組（ND 組）、高脂飲食模型組（HFD 組）各5 只，分別喂以常規飼料、高脂飼料，飼喂10 周，以HFD 組大于ND 組平均體質量的20%作為肥胖模型建立成功標準。每周記錄小鼠體質量。

1.3 脂肪組織獲取 干預10 周，將小鼠頸部脫臼處死，取肩胛間棕色脂肪組織（BAT）、腹股溝白色脂肪組織（iWAT）、附睪白色脂肪組織（eWAT）置于液氮中保存。

1.4 脂肪組織轉錄組測序（seq） 將HFD 組中的iWAT 樣本1（iWAT1）、iWAT 樣本2（iWAT2）、eWAT樣本1（eWAT1）、eWAT 樣本2（eWAT2）、BAT 樣本1（BAT1）、BAT樣本2（BAT2）；ND組中的iWAT樣本1（iWAT1）、iWAT 樣本2（iWAT2）、eWAT 樣本1（eWAT1）、eWAT 樣本2（eWAT2）、BAT 樣本1（BAT1，由于ND 組小鼠BAT 少，在測序時將兩個樣品的BAT 合并為1 份）交于美吉生物醫藥科技有限公司（上海）進行RNA-seq。數據準確可靠標準：錯誤率＜0.1%；堿基質量值（Q），Q20（測序質量在99%以上的堿基占總堿基的百分比）＞85%；Q30（測序質量在99.9%以上的堿基占總堿基的百分比）＞80%；Total mapped（能定位到基因組上優化后的數據百分比）＞80%為獲得的數據準確可靠。主成分分析（PCA）方法：將原來變量（HFD 組和ND 組中所有樣本經測序所獲得的原始數據）重新組合成一組新的互相無關的幾個綜合變量（即主成分PC1 和PC2），所有因素按重要性排序，忽略掉靠后的微小因素，簡化數據。通過PCA 找出離群樣品、判別相似性高的樣品簇，挖掘樣品間的關系和變異。

1.5 差異表達基因篩選及功能分析 用DESeq2軟件進行基因差異分析，篩選標準：P＜0.05、差異倍數（FC）值1.5～2。基因本體論（GO）功能富集分析：采用Goatools 軟件對基因集中的基因/轉錄本進行富集分析，用Fisher 精確檢驗。京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析：采用R 語言腳本對基因集中的基因/轉錄本進行富集分析，用Fisher 精確檢驗。為避免假陽性，用多種多重檢驗方式校正P值，P＜0.05為此功能存在顯著富集。

1.6 統計學方法 采用GraphPad Prism9.0 統計軟件。計量資料比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組體質量變化 見圖1。

圖1 兩組小鼠體質量變化比較

2.2 兩組脂肪組織seq 質量評估結果 錯誤率均＜0.1%，Q20＞85%，Q30＞80%，說明本次測序獲得的數據準確可靠。見表2。

表2 測序數據質控統計結果（%）

2.3 PCA分析結果 各個組可較為明顯的區分，每組組內樣本均聚成各自較為獨立的區域，組內的差異性明顯小于組間的差異性。見圖2。

圖2 PCA分析結果

2.4 差異表達基因篩選結果 在iWAT 中表達上調基因2 548個，表達下調基因2 082個；在eWAT 中表達上調基因3 384 個，表達下調基因2 780 個；在BAT 中表達上調基因1 630 個，表達下調基因1 128個。三種脂肪組織共同差異表達的基因958 個，占10.55%；在iWAT 與eWAT 間共同差異表達的基因1 654 個，占18.22%；在iWAT 與BAT 間共同差異表達的基因331 個，占3.65%；在eWAT 與BAT 間共同差異表達的基因571個，占6.29%。

2.5 差異表達基因GO 功能富集分析結果 HFD組三種脂肪組織的差異表達基因在BP中均有富集。在三種脂肪組織表達全部上調基因中，主要富集在炎癥反應和免疫反應等過程；在三種脂肪組織表達全部下調基因中，主要富集在脂質代謝和小分子代謝等過程。見圖3。

圖3 HFD組三種脂肪組織中差異表達基因的GO功能富集分析

2.6 差異表達基因KEGG通路富集分析結果 HFD組三種脂肪組織差異表達基因富集的信號通路包括PI3k-Akt、NF-kappa B、Toll-like receptor、T cell receptor、Insulin信號通路。見圖4。

圖4 HFD組三種脂肪組織中差異表達基因的KEGG通路富集分析

2.7 不同脂肪組織前20 個與炎癥相關表達上調基因 三種脂肪組織中前20 個與炎癥相關表達上調基因見表3，其中ITGAD 基因在三種組織中均表達上調。

表3 不同脂肪組織前20個與炎癥相關表達上調基因

3 討論

在人類和嚙齒動物研究中，由于高脂飲食引起的肥胖，經常觀察到脂肪組織和肝臟中有代謝炎癥［8］。脂肪組織不僅是被動的能量儲存庫，還具有調節全身代謝穩態的能力。在肥胖狀態下，脂肪細胞會分泌一系列炎癥因子，除引起全身性的慢性炎癥外，還會使肥胖患者體內代謝紊亂，如胰島素抵抗、2 型糖尿病、非酒精性脂肪肝等［5］。肥胖和炎癥的關系密不可分，相互轉化，互為因果。因此可通過減緩或逆轉脂肪炎癥來抑制肥胖相關疾病的發生。

脂肪組織按其形態和功能可分為WAT 和BAT，而WAT 又可根據解剖位置的不同分為皮下WAT（SAT）和內臟WAT（VAT）。有證據指出，無論是肥胖小鼠［9］還是肥胖人類［10］，VAT 中的巨噬細胞要比SAT 中多，而且在肥胖和胰島素抵抗的情況下，VAT中脂肪細胞的肥大程度也遠超于SAT［11］。因此認為VAT 中的炎癥反應會比SAT 更加復雜和強烈。與WAT 相比，在生理學和病理學中對BAT 的炎癥狀態知之甚少。由于BAT 可以將能量以熱量的形式耗散來保護動物免受體溫過低的影響，故還具有抗肥胖和抗糖尿病的作用。越來越多的證據表明，炎癥會通過損害BAT 的能量消耗和葡萄糖攝取能力，直接改變其產熱活性［12］。因此，要想真正了解炎癥的發生、發展機制，就要從不同脂肪組織在炎癥狀態下所有差異表達的基因入手。

轉錄組學是研究生物體內所有基因的表達情況的一項技術，對于研究基因調控、疾病發生和發展、藥物研發等具有重要意義。在本研究通過轉錄組學對高脂飲食誘導的肥胖小鼠模型中的不同組織進行測序。在數據分析過程中需對測序結果進行質量評估，以確保本次測序獲得的數據準確可靠。Q 在生物物理學中是堿基識別出錯概率的整數映射，用于分析每個堿基被識別錯誤的概率，其值越高表明堿基識別越可靠。質控標準中的Q20表示該堿基錯誤的概率為0.01，Q30表示錯誤率為0.001。一般Q20在85%以上、Q30 在80%以上視為測序質量較好。本研究結果中Q20＞85%、Q30＞80%，說明本次測序獲得的數據準確可靠，可以進行后續分析。

為了挖掘樣品間的關系和變異，通過PCA 找出離群樣品、判別相似性高的樣品簇。研究結果顯示最主要的兩個主成分方差貢獻率分別為51.81%、19.08%，并將平面劃分為四部分。從樣本的聚類距離來看，HFD 組的iWAT1 和iWAT2、eWAT1 和eWAT2、BAT1 和BAT2 樣本間相似性較高，而iWAT、eWAT、BAT 之間則有很大的離群性，同樣在ND 組也如此。本研究樣品在不同組別（HFD 組和ND 組）和組織（WAT 和BAT）間都呈現了一定的差異性，有利于開展后續的差異表達分析。

由于不同組織間的差異表達基因可能在炎癥的發生、發展中起重要作用，因此本研究篩選了不同脂肪組織間的差異表達基因。在三種脂肪組織間表達上調的基因和表達下調的基因各不相同，其中eWAT 表達上調和下調的基因最為顯著，而iWAT 次之，BAT 最少。這有可能是脂肪組織的發育起源和功能造成的差異。白色脂肪細胞主要來源于成肌因子5陰性細胞，而棕色脂肪細胞起源于成肌因子5陽性細胞［13］。除起源不同外，它們的生物學功能也完全不同。白色脂肪細胞主要負責能量的儲存和動員。此外，白色脂肪細胞還參與激素分泌、免疫應答等過程。另一方面，棕色脂肪細胞則可以通過非顫栗性產熱的方式消耗能量以維持核心體溫。為一進步探討炎癥和脂肪組織的關系，本研究又對三種脂脂肪組織的差異表達基因做了GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。GO 功能富集分析顯示在三種脂肪組織表達全部上調基因中，主要富集在炎癥反應和免疫反應等過程；而在三種脂肪組織表達全部下調基因中，主要富集在脂質代謝和小分子代謝等過程。這是因為越來越多的脂質及其代謝產物被認為是復雜信號通路的關鍵參與者，這些信號通路以多種方式調節巨噬細胞，如調節巨噬細胞對病原體的反應和吞噬作用［14］。在KEGG 通路富集分析中又得到了充分的驗證，一些經典的炎癥信號通路包括PI3k-Akt、NF-kappa B、Toll-like receptor、T cell receptor均顯著上調。以上結果說明在炎癥的發生、發展中三種脂肪組織均發生了強烈的脂質分解和代謝活動，相關基因的參與和調控作用或許可以解釋由肥胖引發的炎癥向代謝紊亂轉變的過程。

雖然在炎癥狀態下不同脂肪組織間的差異表達基因存在明顯差距，但究竟哪些基因在炎癥過程發揮主導作用尚不清楚。為了能找出調控炎癥的準確靶點，本研究對BAT、iWAT、eWAT 三種脂肪組織中表達上調最明顯的前20 個基因進行分析，發現ITGAD 基因在三者中表達上調都比較明顯。研究表明，ITGAD 基因參與調控脂肪的新陳代謝和血糖平衡，對動物生長發育和脂肪沉積有重要作用［15］。GPR50 基因在HFD 小鼠的iWAT 和eWAT 中表達上調，但卻在BAT 中表達上調不明顯。在2 型糖尿病小鼠的脂肪組織中也可以觀察到GPR50 的表達顯著增加，而GPR50的缺乏增強了3T3-L1細胞的炎癥反應，并誘導蛋白激酶B（Akt）和胰島素受體底物1（IRS1）的磷酸化。此外，敲除3T3-L1 細胞系中GPR50 會抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的表達。表明GPR50 可以減輕脂肪細胞中的炎癥反應并調節胰島素信號傳導，而這種作用是通過IRS1/AKT 信號通路和PPARγ 表達來介導的［16］。CCR3 基因主要在過敏性鼻炎中發揮作用，它通過抑制過敏性鼻炎小鼠PI3K/Akt通路，降低嗜酸性粒細胞炎癥和Th2 免疫反應［17］。GDF3 基因盡管在脂肪細胞和脂肪組織巨噬細胞（ATM）中各有表達，但ATM 被認為是GDF3 的主要來源，其在ATM 中的表達可以通過胰島素或NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3 炎癥小體來調節［18］。低水平的胰島素會刺激GDF3的表達，而GDF3會抑制脂肪組織中的脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）表達和脂肪分解。此外，ATM 中炎癥小體介導GDF3激活，并抑制兒茶酚胺誘導的ATGL 活化和衰老小鼠脂肪細胞中的脂肪分解［18］。GDF3 作為激活素受體樣激酶7 的配體，降低脂肪細胞中PPARγ 或CCAAT/增強子結合蛋白α 的活性［19］。PPARγ 與GDF3 的增強子結合，并激活其在巨噬細胞中的轉錄，以控制骨骼肌再生過程中的組織修復［20］。然而，GDF3 在ATM 中的表達如何被調節仍未確定。其余表達上調基因均參與了炎癥反應。

綜上所述，高脂飲食誘導的肥胖會引發一系列的炎癥反應，而不同脂肪組織中的炎癥表現也各有差異。在臨床中，可將減輕肥胖患者中的脂肪組織炎癥反應作為治療肥胖及其相關代謝疾病的潛在策略。