二氫楊梅素對LPS/ATP誘導血管內皮細胞NLRP3炎癥小體活化的影響及機制

喬秀梅，厲彥翔，薛彩彩，陳心茹，袁浩銘，王金紅

山東第二醫科大學藥學院，山東 濰坊 261053

研究發現，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體是機體抵抗外源病原體感染和消除內源危險因子刺激的重要免疫屏障［1］。我們前期研究結果表明，NLRP3 炎癥小體的異常活化可觸發血管內皮細胞炎癥反應，進而參與動脈粥樣硬化的發生、發展［2-4］。二氫楊梅素（DHM）是一類廣泛存在于葡萄科蛇葡萄屬植物中的黃酮類化合物［5］。現代藥理學研究發現，DHM 能夠抗炎、抗氧化、調節脂代謝，具有潛在的抗動脈粥樣硬化作用［6-7］。然而，DHM是否通過調控血管內皮細胞NLRP3炎癥小體的活化進而發揮抗動脈粥樣硬化作用尚未見報道。2021 年12 月—2022 年12 月，我們在既往研究基礎上觀察DHM 對脂多糖（LPS）/三磷酸腺苷（ATP）誘導的血管內皮細胞NLRP3炎癥小體活化的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 DHM 由上海源葉生物科技有限公司提供；人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自American Type Culture Collection（ATCC，CRL-1730）；LPS、ATP購自美國Sigma Aldrich 公司；DMEM/F-12 培養基和胎牛血清購自美國Hyclone 公司；半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1（caspase-1）、接頭蛋白ASC（CARD）、沉默信息調節因子1（SIRT1）、β-actin、辣根過氧化物酶標記抗體（IgG-HRP）等抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；NLRP3抗體購自英國Abcam公司；IgG-FITC抗體購自武漢Abbkine公司。

1.2 細胞培養 將HUVEC 細胞置于含10%胎牛血清的DMEM/F-12完全培養基中，于37 ℃、5% CO2條件下培養，隔24 h換1次完全培養基，待細胞生長至對數生長期，使用0.25%胰蛋白酶消化液消化細胞，將細胞懸液接種于細胞培養皿中培養并用于后續實驗。

1.3 細胞分組及處理 取對數生長期細胞并隨機分為正常對照組、模型組、DHM 組。DHM 組給予不同濃度（25、50、100 μmol/L）DHM 預孵育細胞1 h，正常對照組加入100 μL 培養基，其余各組每孔加入100 μL 0.5 μg/mL 的LPS 刺激細胞3.5 h，加入5 mmol/L ATP處理細胞30 min。

1.4 NLRP3、ASC、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1 前體蛋白（pro-caspase-1）、剪切體半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1（cleaved caspase-1）、SIRT1蛋白檢測 采用Western blotting 法。取各組細胞加入RIPA裂解液冰浴裂解細胞，提取細胞總蛋白。蛋白定量BCA 試劑盒定量后，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法分離目的蛋白并轉移到PVDF 膜上。PVDF 膜以5%脫脂牛奶封閉后，加入NLRP3（1∶4 000）、ASC（1∶1 000）、caspase-1（1∶1 000）、SIRT1（1：1 000）和β-actin（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜，加二抗，室溫下孵育2 h 后顯影。以β-actin 為內參，Quantity One軟件分析NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved caspase-1、SIRT1蛋白相對表達量。

1.5 SIRT1的功能分析 采用DAVID數據庫，基因本體論（GO）分析包括生物過程（BP）、分子功能（MF）、細胞組分（CC）；京都基因與基因組百科全書（KEGG）進行通路富集分析。采用人工注釋轉錄調控網絡數據庫（TRRUST）中轉錄調控網絡分析SIRT1調控的靶基因并構建網絡圖。

1.6 SIRT1 的定位檢測 采用免疫熒光法。取各組細胞，用4%多聚甲醛固定，以0.3% Triton X-100透化30 min，正常山羊血清封閉。加入適量SIRT1（1∶50）一抗，4 ℃避光孵育過夜，IgG-FITC 抗體室溫避光孵育2 h，DAPI 染液染細胞核后于熒光顯微鏡（×200）下觀察。用ImageJ 軟件分析細胞的相對熒光強度。

1.7 DHM 與SIRT1 的作用模式檢測 采用分子對接分析。將蛋白質數據庫中SIRT1蛋白的三維結構作為受體模板并進行必要的修飾，用Sybyl-X 2.0 軟件Surflex-Dock模塊分析DHM與SIRT1的作用模式。1.8 統計學方法 采用SPSS26.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved caspase-1 蛋白表達比較 與空白對照組比較，LPS/ATP 組NLRP3、ASC、cleaved caspase-1 蛋白表達高（P均＜0.05）；與LPS/ATP 組比較，各DHM 組NLRP3、ASC、cleaved caspase-1 蛋白表達低（P均＜0.05）。各組pro-caspase-1 蛋白表達比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 各組NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved caspase-1蛋白表達比較（± s）

表1 各組NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved caspase-1蛋白表達比較（± s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與LPS/ATP組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組LPS/ATP組LPS/ATP+25 μmol/L DHM組LPS/ATP+50 μmol/L DHM組LPS/ATP+100 μmol/L DHM組cleaved caspase-1蛋白0.44 ± 0.06 0.71 ± 0.06*0.60 ± 0.02#0.44 ± 0.02#0.42 ± 0.05#NLRP3蛋白0.11 ± 0.01 0.15 ± 0.01*0.12 ± 0.01#0.10 ± 0.01#0.11 ± 0.01#ASC蛋白0.98 ± 0.08 1.55 ± 0.10*1.33 ± 0.10#1.00 ± 0.08#0.92 ± 0.08#pro-caspase-1蛋白2.31 ± 0.03 2.26 ± 0.20 2.25 ± 0.05 2.12 ± 0.04 2.23 ± 0.06

2.2 SIRT1 的功能 GO 富集分析結果：BP 富集結果顯示與對營養水平的反應等生物過程聯系密切；CC富集結果顯示與染色質沉默復合體等密切相關；MF 富集結果顯示與染色質DNA 結合等分子功能有關（圖1A）。KEGG通路富集分析結果：SIRT1涉及長壽調節通路、脂質與動脈粥樣硬化等信號（圖1B）。SIRT1對IL-1β等靶基因有調控作用，見圖1C。

圖1 SIRT1的功能分析

2.3 各組SIRT1的定位與表達比較 SIRT1主要分布于細胞核內。空白對照組、LPS/ATP 組、LPS/ATP+100 μmol/L 相對熒光強度分別為1.00 ±0.04、0.63 ± 0.05、0.97 ± 0.05。與空白對照組比較，LPS/ATP 組相對熒光強度弱（P＜0.05）；與LPS/ATP 組比較，LPS/ATP+100 μmol/L DHM 組相對熒光強度強（P＜0.05）。

2.4 各組SIRT1蛋白表達比較 空白對照組、LPS/ATP 組、LPS/ATP+25 μmol/L DHM 組、LPS/ATP+50 μmol/L DHM 組、LPS/ATP+100 μmol/L DHM 組SIRT1 蛋白相對表達量分別為1.37 ± 0.05、0.97 ±0.07、0.94 ± 0.09、1.10 ± 0.06、1.42 ± 0.07。與空白對照組比較，LPS/ATP 組SIRT1 蛋白表達低（P＜0.05）；與LPS/ATP 組、LPS/ATP+25 μmol/L DHM組比較，LPS/ATP+50 μmol/L DHM 組、LPS/ATP+100 μmol/L DHM組SIRT1蛋白表達高（P均＜0.05）。

2.5 DHM 與SIRT1的作用模式 DHM 可有效嵌入SIRT1（受體生物大分子）的“活性口袋”。見圖2。

圖2 DHM與SIRT1活性結合區域的分子對接

3 討論

NLRP3 炎癥小體的異常活化可誘發機體炎癥反應，進而參與一系列心血管疾病的發病過程［8-9］。本課題組前期研究發現，調血脂藥物非諾貝特、煙酸等均通過調控血管內皮細胞炎癥反應發揮心血管保護作用［10-11］。本研究探討DHM 對血管內皮細胞NLRP3 炎癥小體活化是否存在調控作用，并觀察DHM可能的初步作用機制，旨在為臨床預防和治療動脈粥樣硬化以及DHM的開發提供思路。

研究表明，在血管損傷的早期階段血管內膜中存在模式識別受體NLRP3 的表達增加［12］。本研究中，LPS/ATP 能夠誘導血管內皮細胞NLRP3 蛋白高表達，而DHM 顯著下調LPS/ATP 誘導的NLRP3 表達。ASC 作為NLRP3 炎癥小體的接頭蛋白，是炎癥小體多蛋白復合體組裝和下游促炎細胞因子IL-1β成熟所必需的［13］。本研究結果顯示，DHM 可抑制LPS/ATP 誘導血管內皮細胞中ASC 表達，表明DHM能夠抑制LPS/ATP 誘導的NLRP3炎癥小體的活化。眾所周知，NLRP3 炎癥小體通過誘導無活性的pro-caspase-1 剪切為有活性的cleaved caspase-1，進而激活下游的炎癥反應［14］。因此，為進一步研究DHM對血管內皮細胞NLRP3炎癥小體活化的影響，本研究同樣檢測了caspase-1 的蛋白表達變化。發現DHM 顯著抑制cleaved caspase-1 表達上調，進一步確認了DHM 對NLRP3 炎癥小體活化的抑制作用。前期研究證實，半必需氨基酸精氨酸通過靶向血管內皮細胞NLRP3 炎癥小體的異常活化發揮獨立抗炎作用［15］。以上研究表明，DHM 可能通過調控血管內皮細胞NLRP3 炎癥小體活化進而發揮潛在的心血管保護作用。

研究證實，SIRT1 已成為防治心血管疾病的重要靶點［16-19］。基于GO 富集分析結果提示SIRT1 與染色質DNA 結合等分子功能有關；進一步進行KEGG 通路富集分析，結果提示，SIRT1 在脂質與動脈粥樣硬化等信號通路發揮重要作用。TRRUST 數據庫在疾病關鍵基因篩選和轉錄因子調控關系分析中廣泛應用［20-21］。本研究結果顯示，NLRP3 炎癥小體活化標志物IL-1β可能是SIRT1的靶基因。但是，DHM 對血管內皮細胞NLRP3 炎癥小體的作用是否與調控SIRT1表達有關尚不清楚。前期研究結果表明，SIRT1 在TNF-α 刺激的血管外膜成纖維細胞中低表達［22］。本研究結果發現，LPS/ATP 刺激同樣抑制血管內皮細胞中SIRT1 表達，而DHM 可明顯上調LPS/ATP刺激的血管內皮細胞中SIRT1表達。

研究發現，甘草苷通過調控氧化型低密度脂蛋白刺激的血管平滑肌細胞SIRT1 表達治療冠心病［23］。另有研究報道，柚皮素通過激活SIRT1 進而延緩高脂飲食誘導ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的血管衰老和病理進程［24］。本研究發現，DHM 能夠明顯逆轉LPS/ATP誘導的血管內皮細胞SIRT1蛋白表達下調。更重要的是，DHM 可能結合到SIRT1 的“活性口袋”進而增加DHM 與SIRT1 活性區域結合的可能性。研究證實，DHM 可增加高膽固醇飲食誘導動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠主動脈SIRT1 的表達［25］。提示DHM 可能通過上調SIRT1 表達發揮潛在的血管內皮細胞保護作用。

綜上所述，DHM可調控血管內皮細胞NLRP3炎癥小體的活化，機制可能與上調SIRT1 表達有關。本研究豐富了藥食同源茶品藤茶主要活性成分DHM 作用的現代科學內涵，也為DHM 的開發和臨床應用提供了新思路。