微小RNA-125a-5p對人鼻咽癌細胞增殖的影響及機制

萬芳竹，張浩炯，張宗璞

1 上海市質子重離子醫院放療科 復旦大學附屬腫瘤醫院放療科，上海 201321；2 上海市放射腫瘤學重點實驗室；3 上海質子重離子放射治療工程技術研究中心；4 復旦大學附屬華山醫院神經外科

鼻咽癌（NPC）是原發于鼻咽部的一類惡性腫瘤，好發于亞洲東部及南非，我國兩廣地區高發［1-2］。早期NPC對放療較為敏感，隨著疾病進展，化療及手術等手段也納入治療策略。雖然NPC的治療手段不斷發展，但由于NPC細胞有著較高的增殖能力，仍有部分患者在放療后出現局部復發［3］，進而導致治療失敗。微小RNA（miR）是一類小的非編碼RNA，其在多種惡性腫瘤中發揮關鍵作用［4-5］。miR-125a 位于11、19、21 號染色體上，并與多種腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移密切相關［6］。研究表明miR-125a 與NPC 化療敏感性相關［7］。含PDZ 結合基序的轉錄共激活因子（TAZ）是Hippo通路中的關鍵分子，可調控組織穩態［8］。TAZ 表達失調與腫瘤發生、發展相關，其過表達可促進腫瘤細胞增殖［9］。miR-125a 可直接調控TAZ 表達，從而影響乳腺癌細胞增殖和存活［10］。而二者在NPC 細胞中的調控關系及其對細胞增殖能力的影響尚不明確。2022 年8 月—2023 年6 月，本研究探討miR-125a 及其潛在下游靶點TAZ 在NPC細胞中的作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人鼻咽癌細胞系（HK-1細胞）及人胚腎細胞永生化細胞系（293T 細胞）均儲存于上海市質子重離子臨床技術研發中心實驗室。CCK-8 試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒均購于碧云天生物技術公司；轉染所需質粒均由上海吉瑪制藥技術有限公司提供；TAZ 抗體、GAPDH 抗體購于英國Abcam 公司。B76707 流式細胞儀購于美國Cytoflex 公司，TOUCH 凝膠電泳成像系統購于美國Bio-Rad 公司，Cytation 3 酶標儀購于美國Cytation 公司，定量PCR儀購于美國QuantaStudio公司。

1.2 細胞培養 HK-1 細胞及293T 細胞均用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基進行培養，培養基中添加100 U/mL 青霉素及100 mg/mL 鏈霉素。培養箱溫度37 ℃，CO2含量5%。待細胞達到可傳代密度（80%～90%）時，用0.25%胰蛋白酶液消化細胞，以1∶3比例傳代。

1.3 細胞轉染及分組 待HK-1 細胞生長狀況良好，將細胞接種于六孔板中，取部分細胞并隨機分為對照1 組、過表達miR-125a 組（轉染miR-125a mimics）、沉默miR-125a 組（轉染miR-125a inhibitor）；另取部分細胞隨機分為對照2 組、miR-125a 過表達組（轉染miR-125a mimics）及回補組（轉染miR-125a mimics 同時過表達TAZ）。依據說明書所示步驟用Lipofectamine ?3000 試劑進行轉染，48 h 后檢測miR-125a表達驗證轉染效率。

1.4 miR-125a-5p、TAZ mRNA檢測 采用RT-qPCR法。用TRIzol 試劑提取細胞總RNA，用分光光度計檢測RNA 濃度。用逆轉錄試劑盒，以總RNA 為模板反轉錄獲得cDNA 后，進行RT-qPCR 檢測。反應體系共25 μL：cDNA 模板2 μL，2×SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 12.4 μL，上下游引物各1 μL，無酶水8.5 μL。反應條件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 40 s、60 ℃ 1 min共35個循環。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。miR-125a-5p 上游引物5'-GGTCATTCCCTGAGACCCTTTAAC-3'，下游引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；TAZ 上游引物5'-ACCCACCCACGATGACCCCA-3'，下游引物5'-GCACCCTAACCCCAGGCCAC-3'；miR-125a-5p的對照U6上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-AACGCTTCACGATTTGCGT-3'；TAZ 的對照GAPDH 上游引物5'-GGAGCCAAAAGGGTCATCAT-3'，下游引物5'-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3'。用2-ΔΔCt法計算目標基因相對表達量。

1.5 TAZ 蛋白檢測 采用Western blotting 法。將各組細胞培養至對數生長期，用RIPA 試劑將細胞裂解，用BCA 法評估蛋白濃度。加入上樣緩沖液并將蛋白于100 ℃下變性10 min。各組蛋白上樣于SDS PAGE 凝膠，電泳后，再將凝膠附于PVDF膜上進行轉膜。封閉液封閉1 h，將膜置于TAZ 一抗（1∶1 000）4 ℃下過夜。將膜洗滌，置于二抗中室溫孵育1.5 h。用增強化學發光法來觀察蛋白條帶。通過ImageJ 軟件分析蛋白條帶的強度并加以量化統計。

1.6 細胞增殖能力檢測 CCK-8實驗：將細胞接種于96孔板中，調整為每孔3×103個細胞，并培養過夜使其貼壁生長。之后每孔加入CCK-8 溶液10 μg/mL，并將96 孔板放入培養箱，37 °C 溫度下避光孵育1 h。用酶標儀檢測450 nm 波長處的吸光度值（OD450值）。集落形成實驗：將每組細胞消化為細胞懸液，接種于六孔板中，每孔細胞調整為1 000 個。將各組細胞培養約14 d，鏡下觀察細胞狀態，確保所形成集落包含50 個以上細胞。PBS 洗滌各孔3 次，用4%多聚甲醛進行固定，用0.1%結晶紫染色細胞，對每個孔中的細胞集落進行拍照并計數。

1.7 miR-125a 與TAZ 的靶向關系分析 通過預測網站TargetScan（http：//www. targetscan. org/）和miRDB（http：//mirdb.org/）預測miR-125a 與TAZ 的結合位點。采用雙熒光素酶報告基因實驗進一步驗證，pGL3-TAZ 和pGL3-mutTAZ 報告基因載體質粒均由Bio-Asia公司（中國）建立。將293T細胞隨機分為4 組：WT+miR-ctrl 組共轉染TAZ 野生型（TAZWT）和miR-125a 空載對照（miR-ctrl）、Mut+miR-ctrl組共轉染TAZ 突變型（TAZ-MUT）和miR-ctrl、WT+miR-125a 組共轉染TAZ-WT 和miR-125a 模仿物（miR-125a）、Mut+miR-125a 組共轉染TAZ-MUT 和miR-125a，轉染48 h 后，用細胞裂解液將細胞分解，用熒光素酶檢測試劑盒檢測報告蛋白的活性。

1.8 統計學方法 采用GraphPad Prism7.00 軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析或雙因素方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染效率 對照1組、過表達miR-125a組、沉默miR-125a 組miR-125a 的相對表達量分別為1.00 ±0.15、1.61 ± 0.11、0.68 ± 0.16，各組比較差異有統計學意義（P均＜0.05）。

2.2 miR-125a對細胞增殖能力的影響 各組轉染后第2、3、4、5、6天細胞增殖活力比較差異均有統計學意義（P均＜0.05），見表1。對照1 組、過表達miR-125a組、沉默miR-125a 組集落形成數分別為（108.00 ±11.14）、（73.33 ± 12.34）、（266.67 ± 36.50）個，各組比較差異有統計學意義（P均＜0.05）。

表1 各組不同時間的增殖活力（± s）

表1 各組不同時間的增殖活力（± s）

組別對照1組過表達miR-125a組沉默miR-125a組OD450值轉染后第1天0.19 ± 0.02 0.19 ± 0.02 0.19 ± 0.03轉染后第2天0.33 ± 0.02 0.31 ± 0.03 0.40 ± 0.03轉染后第3天0.54 ± 0.06 0.41 ± 0.06 0.78 ± 0.11轉染后第4天0.87 ± 0.05 0.63 ± 0.06 0.99 ± 0.07轉染后第5天1.11 ± 0.02 0.80 ± 0.08 1.25 ± 0.10轉染后第6天1.28 ± 0.04 1.03 ± 0.07 1.44 ± 0.05

2.3 miR-125a 下游靶點預測結果用靶點預測網站預測miR-125a的下游靶點之一為TAZ。對照1組、過表達miR-125a組、沉默miR-125a組TAZ蛋白相對表達量分別為0.80 ± 0.05、0.48 ± 0.07、1.23 ±0.11，各組比較差異有統計學意義（P均＜0.05）。

通過預測網站預測miR-125a 與TAZ 的結合位點，并設計突變型序列（TAZ-3'UTR MT），miR-125a與TAZ 的非編碼區結合，miR-125a 的直接下游靶點為TAZ。見圖1。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，WT+miR-ctrl 組、Mut+miR-ctrl 組、WT+miR-125a 組、Mut+miR-125a 組的相對熒光強度分別為1.00 ± 0.03、0.98 ± 0.03、0.56 ± 0.09、0.88 ±0.06。WT+miR-125a 組相對熒光強度低于WT+miR-ctrl 組、Mut+miR-ctrl 組（P均＜0.05），Mut+miR-125a 組相對熒光強度與WT+miR-ctrl 組、Mut+miRctrl 組比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。

圖1 miR-125a與TAZ結合位點及突變型序列

各組細胞轉染后第2、3、4、5、6 天細胞增殖活力比較差異均有統計學意義（P均＜0.05），見表2。對照2 組、miR-125a mimics 組、miR-125a mimics+TAZ組集落形成數分別為（140.33 ± 19.13）、（72.33 ±10.01）、（140.33 ± 19.13）個，各組比較差異有統計學意義（P均＜0.05）。

表2 各組不同時間的增殖活力（± s）

表2 各組不同時間的增殖活力（± s）

組別對照2組miR-125a mimics組miR-125a mimics+TAZ組OD450值轉染后第1天0.20 ± 0.02 0.21 ± 0.02 0.20 ± 0.03轉染后第2天0.33 ± 0.05 0.32 ± 0.03 0.33 ± 0.02轉染后第3天0.58 ± 0.02 0.43 ± 0.02 0.57 ± 0.05轉染后第4天0.88 ± 0.04 0.55 ± 0.03 0.80 ± 0.03轉染后第5天1.05 ± 0.07 0.77 ± 0.02 0.89 ± 0.03轉染后第6天1.25 ± 0.06 0.97 ± 0.06 1.16 ± 0.04

3 討論

探究導致NPC 增殖的分子機制，對制定新的治療策略、延長患者生存時間有重要意義。研究表明，miR 參與調控多種腫瘤的發生、發展［11-12］。LIRUSSI等［13］發現，在雌激素受體陽性的乳腺癌中，微小RNA let-7b-5p 和促癌分子單鏈選擇性單功能尿嘧啶DNA 糖基化酶1（SMUG1）形成抑制性調節環路，降低SMUG1的表達水平，從而發揮抑制乳腺癌發展的作用。LI 等［14］發現，miR-34c 與NPC 患者預后相關，其可通過抑制受體酪氨酸激酶，減弱NPC 細胞的增殖、侵襲、遷移能力。

miR-125a 在頭頸鱗癌等腫瘤中被證實為抑癌基因［15］。在肝細胞癌中，miR-125a 抑制腫瘤壞死因子受體相關因子6 的表達，發揮抑制腫瘤生長的作用；而長鏈非編碼RNA PDIA3P1 通過競爭性結合miR-125a 從而減弱了miR-125a 對肝細胞癌的抑制作用，進而導致腫瘤的化療耐藥［16］。本研究發現，miR-125a 低表達后，NPC 細胞增殖能力有了較為顯著的提升。這說明在NPC 中miR-125a 發揮抑癌作用。

本研究結果顯示，過表達miR-125a 后Hippo 信號通路關鍵分子TAZ 表達降低，敲低miR-125a 則促進TAZ 高表達，符合二者結合的表達趨勢，因此預測miR-125a 的潛在下游靶點為TAZ；雙熒光素酶報告基因實驗發現，miR-125a 可與TAZ 序列的3'UTR區域結合，證明TAZ 是miR-125a 的靶基因。Hippo通路是一條進化上保守的信號通路，參與調節細胞的形態、增殖和遷移，一旦該通路的表達失衡，便會引起細胞增殖能力改變，導致腫瘤的發生、發展［17］。TAZ 通常在腫瘤中表達較高，參與腫瘤細胞的增殖和抗凋亡過程［18］。在NPC 中，愛潑斯坦-巴爾病毒可使TAZ 異常活化，并促進腫瘤細胞的生長和遷移［19］，但尚未有文獻證明miR-125a 可負調控TAZ 從而抑制NPC 細胞增殖。本研究通過體外實驗證明，miR-125a 可抑制TAZ 的表達，從而減弱TAZ 對NPC增殖的促進作用。同時過表達miR-125a 及TAZ 時，miR-125a 的抑癌作用有較大程度的減弱，說明TAZ是miR-125a 有效的下游靶點，miR-125a 對細胞生長的抑制作用很大程度是通過降低TAZ 的表達實現的。這驗證了miR-125a-TAZ 通路的存在，該通路對NPC細胞的增殖能力有調控作用。miR-125a對TAZ乃至Hippo 通路的調控對NPC 的治療有重要臨床意義，可通過小分子藥物等手段恢復NPC 中miR-125a的表達或抑制TAZ 過度活化，從而達到抑制腫瘤生長的目的。然而目前仍有部分問題亟待解答，如miR-125a 對Hippo 信號通路中的其他分子是否有調控作用等，對于這些問題可以后續進一步探究。

綜上所述，miR-125a 可通過下游靶點TAZ 抑制NPC細胞的增殖，其具體作用機制還需進一步挖掘，以期對NPC的診斷和治療提供依據。