視覺發育關鍵期單眼形覺剝奪弱視大鼠視皮層的差異表達基因及其功能分析

李佳芹，畢愛玲，2，畢宏生，2

1 山東中醫藥大學眼科與視光醫學院，濟南 250014；2 山東中醫藥大學附屬眼科醫院實驗中心山東省眼病防治研究院實驗中心 山東省中西醫結合眼病防治重點實驗室

弱視是與視皮層發育相關的臨床常見眼科疾病，綜合患病率高達2%～5%，多見于兒童和青少年［1］。在視覺發育期內，由于單眼斜視、屈光參差、高度屈光不正及形覺剝奪等異常視覺經驗引起單眼或雙眼的最佳矯正視力低于相應年齡的正常人，且眼內無任何器質性病變，排除遺傳相關眼病，則可診斷為弱視［2］。弱視的發病機制復雜，與視覺傳輸通路密切相關，其發病最核心的位置是大腦視皮層［3］。研究發現，視覺發育關鍵期對嚙齒動物進行單眼形覺剝奪（MD），導致初級視皮層神經元的輸入偏好向非剝奪眼發生顯著變化，引起視覺發育相關基因表達異常，影響視皮層結構和功能，導致視覺受損［4］。基因芯片技術是一種運用大量特定序列的基因探針與標記樣品分子進行雜交，通過檢測探針雜交信號強度，獲得相應基因序列信息的基因檢測技術，具有高精確度、高靈敏度、高通量等優勢。基因芯片技術已應用于各研究領域，而有關弱視模型動物視覺皮層基因表達變化的報道較少。2022年7月—2023年2 月，本研究以形覺剝奪弱視大鼠為模型，運用基因芯片技術檢測各樣本視皮層基因表達情況，篩選差異表達基因，運用基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）對差異表達基因進行富集分析，確定弱視相關發病基因及其生物學信息，為分子水平靶向治療弱視提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SD大鼠10只，雌雄各5只，合籠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證編號：SCXK（京）2016-0006，孕24 d 左右娩出幼鼠，均排除眼部器質性疾病。選取出生13 d 尚未睜眼SD 大鼠24 只，雌雄不限，體質量12～15 g。大鼠與幼鼠均飼養于山東中醫藥大學眼病防治研究院，室溫25 ℃、濕度50%、12 h/12 h 晝夜光照節律，飼養期間食物水源充足，自由進食飲水。動物實驗過程嚴格遵守ARVO 原則，實驗動物飼養和使用經山東中醫藥大學實驗室動物管理和使用委員會批準。

1.1.2 實驗試劑 紅霉素眼膏（北京雙吉制藥有限公司），氧氟沙星滴眼液（辰欣偉都藥業有限公司），RNeasy mini kit（德國QIAGEN 公司），Gene Expression Hybridization Kit、Low Input Quick Amp Labeling Kit、One-Color（美國Agilent 公司），RNeasy mini kit（德國QIAGEN 公司），Gene Expression Wash Buffer Kit（美國Agilent公司）。

1.1.3 實驗儀器 手術器械、腦切片模具（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），NanoDrop ND-2000 分光光度計（美國Thermo Fisher 公司），Hybridization Oven、Agilent Bioanalyzer 2100、Agilent Microarray Scanner（美國Agilent 公司），Staining Dishes（美國Thermo Shandon公司）。

1.2 動物分組及單眼形覺剝奪弱視模型制備 將24 只出生13 d 尚未睜眼SD 大鼠按隨機數字表法均分為空白對照組、模型組。模型組參照文獻［5］的方法構建模型，操作方法：經腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液進行麻醉、固定，用復合碘消毒右眼周圍皮膚，切除右眼上下眼瞼0.8～1.0 mm邊緣組織，用眼科縫合針2～4 針間斷縫合上下眼瞼。術后7 d 在創緣處使用氧氟沙星滴眼液和紅霉素眼膏，防止感染。正常光照下飼養大鼠，每天早晚觀察縫合部位，剔除脫線、漏光及眼內感染大鼠。連續飼養45 d 后切開右眼眼瞼邊緣。

1.3 視皮層腦組織獲取 出生60 d，腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液麻醉后快速斷頭處死大鼠，取大腦放于腦切片模具中，參考大鼠腦立體定位圖譜［6］切取雙側視皮層腦組織，放于EP管中，-80 ℃保存備用。

1.4 差異表達基因篩選 采用基因芯片實驗。RNA 的抽提、純化及芯片雜交實驗：用RNeasy mini kit抽提樣品總RNA，并用NanoDrop ND-2000分光光度計及Agilent Bioanalyzer 2100 進行電泳質檢；質檢合格的總RNA 用Agilent 表達譜芯片配套試劑盒進行放大和標記，并用RNeasy mini kit 純化標記后的cRNA；按照Agilent 表達譜芯片配套提供的雜交標準流程進行雜交，在65 ℃、10 r/min滾動雜交爐中滾動雜交17 h，雜交cRNA 上樣量1.65 μg；雜交后，使用Gene Expression Wash Buffer Kit 在洗缸中洗片；使用Agilent Microarray Scanner 對雜交芯片進行掃描，軟件設置Dye channel： Green， Scan resolution=3 μm，PMT 100%，20 bit。用Feature Extraction software讀取基因芯片掃描原始數據，用R軟件中limma包Quantile 算法對原始數據進行歸一化處理。繪制箱線圖，觀察樣本數據分布的總體特征。用表達差異倍數及t檢驗對差異表達基因進行篩選，篩選標準為表達差異倍數≥2 且P＜0.05。采用火山圖分析兩組間差異基因總體分布情況，聚類熱圖分析組內各樣本間差異基因的分布。

1.5 差異表達基因GO 和KEGG 富集分析 用GO和KEGG 工具對差異表達基因進行富集分析。挑選標準：term/GO 或term/pathway 上至少存在2 個差異表達基因（P＜0.05）。篩選出基因富集顯著的功能和信號通路，按照Enrich factor 值從大到小降序排列，取前30個結果制作可視化氣泡圖。

2 結果

2.1 差異表達基因篩選結果 將原始數據經過均一化和對數轉換處理，繪制得到箱線圖，見圖1，數據中位數基本為一條直線，各樣本間具有可比性。模型組與空白對照組視皮層差異基因總體表達情況見圖2。其中，左側視皮層差異表達基因共163 個，表達上調基因28個、表達下調基因135個；右側視皮層差異表達基因數共38 個，表達上調基因25 個、表達下調基因13個。共獲得16個共有差異表達基因，表達上調基因9個、表達下調基因7個。

圖1 箱線圖

圖2 大鼠左側、右側視皮層差異表達基因火山圖

2.2 差異表達基因GO 富集分析結果 空白對照組與模型組左側視皮層差異表達基因進行GO 富集分析，選取富集最顯著的30 個功能，其中富集程度大于2 的GO 條目共有22 個，參與分子功能的條目有5 個，包含核糖體的結構成分、結構分子活性、氧化還原酶活性、轉運蛋白活性、氣味結合；參與細胞組成的條目有8個，包含細胞質核糖體大亞基、核糖體大亞基、細胞質核糖體、核糖體亞基、核糖體、細胞體、核糖核蛋白復合物、細胞質；參與生物過程的條目有9 個，包含蛋白質翻譯、感覺器官發育、氧化還原過程、器官形態形成、離子跨膜運輸、細胞增殖正調節、羧酸代謝過程、有機環化合物反應、有機酸代謝過程。

空白對照組與模型組右側視皮層差異表達基因進行GO 富集分析，選取富集最顯著的30個功能，其中富集程度大于2 的條目共有19 個，參與分子功能的條目有4個，包含蛋白質二聚化活性、相同蛋白結合、受體結合、水解酶活性；參與細胞組成的條目有1 個，構成神經元細胞突起；參與生物過程的條目有14 個，包含多細胞生物繁殖過程、化學穩態、穩態過程、繁殖、移動、基因表達正向調控、組織發育、細胞代謝過程負調控等。

2.3 差異表達基因KEGG 富集分析結果 對空白對照組與模型組左側視皮層差異表達基因進行KEGG 富集分析，篩選出富集程度最顯著的30 個信號通路，包括胚胎背腹軸線形成、光信號傳導通路、血管內皮生長因子（VEGF）信號通路、氧化磷酸化信號通路、醛固酮調節的鈉重吸收信號通路、碳水化合物的消化吸收信號通路、B 細胞受體信號通路等，見圖3。空白對照組與模型組右側視皮層差異表達基因KEGG 信號通路主要富集于維生素消化和吸收、脂肪消化和吸收、長期抑制、血管平滑肌收縮、肌動蛋白骨架的調節通路、神經活性配體-受體相互作用信號通路、癌癥信號通路、嗅覺傳導信號通路。

圖3 左側視皮層差異表達基因KEGG富集分析氣泡圖

左、右兩側視皮層差異基因的KEGG 富集代謝通路不盡相同，其中與視覺相關的主要代謝通路包括背腹軸形成、光信號傳導通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、核苷酸結合寡聚化結構域（NOD）樣受體信號通路、神經營養蛋白信號通路、神經活性配體—受體相互作用信號通路等。其中與視功能異常改變有關的大部分通路集中在MAPK1、鳥氨酸結合蛋白Gα2（GNAT2）基因。

3 討論

MAPK 是一種常見的細胞內信號通路，在癌發生、促進癌細胞增殖和遷移、抑制凋亡和刺激血管生成中起著至關重要的作用［7-8］。MAPK1 是MAPK 信號傳導通路的重要蛋白質編碼基因，又稱ERK1/2或p44/42。在正常情況下，其位于細胞質中，在高糖、各種生長因子、過氧化氫、離子射線等刺激下磷酸化激活，促進基因轉錄和表達，參與細胞增殖和分化［9］。在哺乳動物細胞中，與MAPK1 相關的細胞內信號轉導途徑被認為是經典的MAPK 信號轉導途徑［10-11］。γ-氨基丁酸（GABA）是大腦中主要抑制性神經遞質，介導視皮層興奮性神經元形態和功能改變［12-13］。腦源性神經營養因子（BDNF）是由視網膜中的神經元產生的神經營養因子，廣泛存在于中樞神經系統，參與調節視皮層可塑性、調控視覺系統神經發育、調節突觸發生和神經保護［14-15］。研究表明，在視覺早期發育過程中，興奮性GABA 和BDNF 之間依賴MAPK信號傳導通路形成正反饋回路，其中，GABA 刺激BDNF 表達，BDNF 促進GABA 的突觸釋放［16］。異常的視覺刺激引起GABA 表達變化，使神經元產生異常視覺沖動，并且通過MAPK信號通路，刺激BDNF 異常表達，引起突觸結構改變和視覺神經元異常發育，導致弱視發生。另外，MAPK1 通路激活，進一步介導一氧化氮合酶（NOS）表達和一氧化氮（NO）產生［17-18］。NO通過加強谷氨酸的釋放，參與視覺沖動的產生、整合與傳遞，對視覺的發育有重要影響［19］。在弱視貓模型、形覺剝奪弱視大鼠模型的研究中，分別檢測出視網膜與大腦視皮層NOS、GABA 的表達明顯減少［20-21］。可以推測，NOS的降低導致NO 合成減少，影響視覺發育，進而導致弱視。另外，BDNF 與谷氨酸突觸表達調控長時程增強（LTP）過程也密切相關，代謝型谷氨酸受體激活引起神經興奮性信號傳遞，并介導細胞內級聯反應，誘導LTP，改變神經可塑性，參與視皮層發育［22-23］。

GNAT2 基因包含8 個外顯子，共編碼354 個氨基酸，主要功能為光信號傳導通路［24］。研究證實，GNAT2 參與的光信號傳導通路與視功能作用發揮密切相關。光信號傳導通路中，GNAT2 主要參與編碼視錐轉導G 蛋白的α 亞基及視錐體光感受器中GTP 酶的活化過程［25］。在視錐光感受器中，光刺激激活光色素與轉導蛋白（G 蛋白）的相互作用，刺激結合的GDP 交換為GTP。與GTP 結合的視錐細胞特異性α 轉導素亞基從其β 和γ 亞基釋放，并通過從cGMP-磷酸二酯酶的活性位點去除抑制性γ 亞基來激活該酶。cGMP 磷酸二酯酶降低了光感受器中cGMP 的濃度，引起cGMP 門控通道關閉和光感受器的超極化。RONNING 等［26］對敲除小鼠GNAT2 基因，發現GNAT2表達缺失情況下不存在視錐驅動的視網膜信號傳導。另外，研究結果顯示單眼形覺剝奪GNAT2-/-小鼠的屈光偏移幅度較GNAT2+/+小鼠大兩倍［27］。以上研究表明，GNAT2 基因是光信號傳導通路的關鍵基因，敲除GNAT2基因會引起視網膜光信號傳導異常，導致小鼠屈光發育異常，進而引起視覺發育的不完善，導致弱視形成。多巴胺（DA）是弱視發病分子機制中的中樞神經系統關鍵調控遞質，參與視覺發育關鍵期視覺神經元的發育成熟、突觸結構的可塑性等過程［18，28］。PARK等［29］發現，具有非功能性視桿細胞的GNAT1-/-小鼠由于DA 的代謝異常，導致其在產后1～4周DA 代謝產物3，4-二羥基苯乙酸水平下降，引起屈光發育異常。另外，由于ON通道缺陷導致DA 緊張性水平降低［30］或光感受器變性［31］也增加了對形覺剝奪性視覺異常發育的易感性。這些結果表明，DA對屈光發育和形覺剝奪異常視覺表現具有復雜作用，在視覺發育過程中，DA 可能出現中樞神經系統視覺分子信號異常表達，從而增加視覺發育異常的易感性。

本實驗采用健康大鼠，在其視覺發育關鍵期進行右眼單眼縫合，以異常視覺經驗誘導建造形覺剝奪弱視大鼠模型。運用基因芯片技術檢測左、右眼對應大腦視皮層基因表達情況，發現大量基因表達顯著下調，少量表達上調。對差異基因進行篩選，發現弱視模型大腦視皮層中MAPK1 基因表達下調，GNAT2 基因表達上調。MAPK1 基因表達下調表明弱視狀態下，與視覺信號傳導相關的細胞信號途徑發生了變化，影響了視覺沖動的產生、整合與傳遞，進一步影響了視覺神經元異常發育和連接。G 蛋白在視網膜的視覺傳導途徑中參與感光色素激活、二次信號傳導等過程。GNAT2 基因表達上調反映了對視覺信號傳導的一種代償性反應，即在弱視條件下，生物體試圖通過增加GNAT2的表達來增強對有限視覺輸入的感知。

綜上所述，形覺剝奪弱視模型大鼠視皮層MAPK1 基因表達下調，由MAPK1 介導的NOS、NO表達降低，以及GABA、BDNF 參與的視覺信號通路及生物學活性表達限制，可能是形覺剝奪弱視相關的分子學生物途徑。另外，形覺剝奪弱視模型大鼠GNAT2 基因表達上調，可能導致視錐驅動的視網膜信號傳導異常，進一步導致視覺光信號轉導異常，并且伴隨DA 對形覺剝奪視覺發育的影響，可能是弱視形成的另一分子機制。本實驗從基因層面分析了影響弱視形成的大腦視皮層神經系統發育、神經元突觸結構變化和功能可塑性的過程，為弱視治療、視覺信號轉導及大腦視覺發育的可塑性研究提供了新的方向。當然，未來仍需結合目標基因對具體的分子機制進行探索。