AGPS 在神經膠質瘤細胞中的相互作用蛋白及作用模式

劉穎，馬英，朱彧

1 天津市環湖醫院檢驗科，天津 300350；2 天津醫科大學藥學院；3 天津市第三中心醫院檢驗科

神經膠質瘤是最常見的原發性中樞神經系統腫瘤［1］。烷基甘油酮磷酸合酶（AGPS）是醚酯合成的關鍵酶，AGPS 將酰基甘油-3-磷酸轉化為烷基甘油-3-磷酸，這是生成所有醚類脂質的必要步驟［2］。腫瘤細胞以不同于正常細胞的方式代謝脂質，腫瘤中醚類脂質的含量高于正常組織，并且在高侵襲性腫瘤中醚脂表達水平增高，對腫瘤細胞的致病性具有至關重要的作用［3］。研究顯示，沉默AGPS表達能夠降低神經膠質瘤細胞侵襲性，說明AGPS 對于維持腫瘤細胞形態和致病特性具有重要意義［4-5］。但是，AGPS的相互作用蛋白尚未見報道。2020年1月—2022 年12 月，本研究通過免疫共沉淀（Co-IP）技術和質譜技術確認AGPS 的相互作用蛋白，并推測二者結合位點，為今后AGPS機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 神經膠質瘤細胞（U251 細胞）購自中國醫學科學院基礎醫學研究所。慢病毒空載體和AGPS shRNA 慢病毒、AGPS、HNRNPK 抗體、驢抗鼠IgG 二抗、驢抗兔IgG 二抗購自美國Santa Cruz 公司，胎牛血清和DMEM 培養基購自美國Corning公司，放射免疫沉淀法裂解緩沖液、Protein A 瓊脂糖珠購自碧云天生物技術有限公司，EASY-nLC 1000 高效液相色譜和Q-Exactive 質譜分析儀購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 細胞培養 以含有10%胎牛血清的DMEM 培養基37 ℃、5% CO2孵箱培養細胞，待細胞基本融合成片后，經0.25%胰酶消化后進行傳代。

1.3 慢病毒感染及穩定細胞系篩選 慢病毒感染前1 d，將細胞接種于6孔板中（2×105/孔），過夜后更換含20%聚凝胺的DMEM 培養基。將細胞隨機分為對照組、shR-AGPS-1組、shR-AGPS-2組，分別加入陰性對照慢病毒和不同沉默水平的AGPS shRNA 慢病毒，24 h 后更換為不含聚凝胺的DMEM 完全培養液，37 ℃繼續培養72 h。加嘌呤霉素（1 μg/mL），每3天換1次篩選液繼續進行篩選，稀釋單細胞懸浮液獲得單克隆AGPS沉默細胞系，37 ℃、5% CO2條件下培養72 h，進行后續實驗。

1.4 AGPS 蛋白檢測 采用Western blotting 法。將細胞裂解后提取總蛋白，將蛋白樣品通過8%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，轉至PVDF 膜，置于5%脫脂牛奶，室溫封閉2 h，分別置于含AGPS 抗體和IgG 的5%脫脂牛奶中，4 ℃搖動，過夜。將膜置于TBST 溶液中，搖動漂洗5 min，共4次，于含HRP-二抗的5%脫脂牛奶中室溫孵育1.5 h。將膜置于TBST 溶液中漂洗，將膜置于Western LightningTMChemiluminescence Reagent 顯色劑中30 s 后進行成像化處理，通過ImageJ 軟件測算AGPS蛋白相對表達量。

1.5 AGPS相互作用蛋白篩選

1.5.1 Co-IP實驗 通過Co-IP實驗制備抗原-蛋白復合物，特異性富集AGPS 蛋白。將各組細胞刮下，加入預冷的放射免疫沉淀法裂解緩沖液，4 ℃，緩慢晃動15 min，14 000 g 離心15 min（半徑15 cm），Protein A 瓊脂糖珠（100 μL/mL 總蛋白），4 ℃搖動10 min，14 000 g 離心15 min（半徑15 cm），去除Protein A 珠子。將總蛋白稀釋至1 μg/μL。分別將兔抗AGPS 抗體和兔抗IgG 各6 μg 加入500 μL 總蛋白中，4 ℃孵育過夜，加入100 μL Protein A 瓊脂糖珠，4 ℃孵育過夜，14 000 g 離心15 min（半徑15 cm），去上清液，用預冷的放射免疫沉淀法裂解緩沖液洗滌，經緩沖液重懸后煮5 min，保存上清液。

1.5.2 銀染實驗 通過銀染實驗檢測聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質。將Co-IP 實驗獲取的上清液經8% SDS-PAGE 分離蛋白，電泳結束后，將凝膠浸泡在固定液（乙醇∶冰醋酸∶水=30∶10∶60）中12 h 固定蛋白。加入30%的乙醇搖動30 min 后棄乙醇，并重復1次；將凝膠在去離子水搖動10 min，并重復2次。加入0.1%硝酸銀溶液搖動30 min，棄硝酸銀溶液，用去離子水漂洗凝膠，加入新鮮顯影液（2.5%碳酸鈉、0.02%甲醛的水溶液），待出現蛋白質的染色條帶，用1%乙酸終止反應。膠上出現相對分子質量不同于AGPS 蛋白的其他蛋白，切膠后送質譜檢測，篩選可能與AGPS相互作用的蛋白。

1.5.3 質譜實驗 將上述銀染膠中其他蛋白切成1 mm3小塊，200 μL 水洗2 次，每次10 min，加考染脫色液200 μL 超聲脫色15 min，重復3 次，至脫色完全。加乙腈100 μL 脫水至膠粒變白，真空抽干10 min，加10 mmol/L 二硫蘇糖醇（25 mmol/L 碳酸氫銨溶解）200 μL，37 ℃水浴1 h，冷至室溫，吸干，快速加50 mmol/L 吲哚乙酸（25 mmol/L 碳酸氫銨溶解）200 μL，置于暗室45 min，依次用25 mmol/L 碳酸氫銨（2 次）、25 mmol/L 碳酸氫銨+50%乙腈（2次）、乙腈（1 次）洗滌，每次10 min。乙腈脫水后將0.1 μg/μL 胰蛋白酶酶液用25 mmol/L 碳酸氫銨稀釋，4 ℃放置30 min，加25 mmol/L碳酸氫銨至總體積600 μL，37 ℃過夜，離心收集酶解上清液，真空超干，進行液相（EASY -nLC 1000 System Thermo）和質譜分析（Q-Exactive，Thermo）。用Proteome Discoverer1.4軟件鑒定質譜結果，銀染膠中獲得蛋白信息。

1.6 同源模建 用同源模建技術構建HNRNPK 蛋白的三維立體結構。按照文獻［6］的方法進行同源模建和蛋白間模擬對接。用Discovery studio v3.5中的“Build Homology Models”模塊以人源HNRNPK 氨基酸（UniProt ID：P61978）為目標序列作為模板構建HNRNPK 的3D 結構，經MODELER 構建目標序列的3D 結構。應用GROMACS v4.5.5 軟件包和GROMOS 43a1 力場對最優HNRNPK 模型進行分子動力學研究，采用PME 法計算長程靜電勢，進行分子動力學模擬，使用Ramachandran plot 和Profile-3D 對優化后的結構進行評估。

1.7 蛋白間模擬對接 使用Discovery Studio v3.5中“prepare protein”對HNRNPK 和AGPS（UniProt ID：O00116）進行結構優化，用ZDOCK 模塊預測HNRNPK 與AGPS 的復合物結構。設置旋轉采樣的配體方向歐拉角度步長設定為6，“RMSD Cutoff”設定為6.0，“Interface Cutoff”設定為9.0，“Maximum Number of Clusters”為60，結合模式“Top Poses”設定為2 000，進行計算，選出RMSD＜3?的構象。分別應用“Analyze Protein Interface”“Calculate Electrostatics”模塊和“Calculate Interaction Energy”模塊計算HNRNPK 蛋白和AGPS 蛋白相互作用的關鍵氨基酸殘基、靜電相互作用和相互作用能，預測HNRNPK與AGPS蛋白間的結合位點。

1.8 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，兩組比較采用t檢驗；多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AGPS 的沉默效率 對照組、shR-AGPS-1 組、shR-AGPS-2 組AGPS 相對表達量分別為1.00 ±0.23、0.57 ± 0.05、0.23 ± 0.04。與對照組比較，shR-AGPS-1 組、shR-AGPS-2 組AGPS 表達低（P均＜0.05），且shR-AGPS-1組AGPS表達低于shR-AGPS-2組（P＜0.05）。

2.2 AGPS 相互作用蛋白篩選結果將AGPS 抗體分別與U251 細胞系對照組和shR-AGPS-1/2 組進行免疫共沉淀。將免疫共沉淀復合物進行凝膠電泳和銀染后，膠上出現相對分子質量不同于AGPS 蛋白的其他蛋白，55～70 kD 左右應為AGPS 蛋白條帶，50、27 kD 處條帶明顯且比較均勻的條帶可能為抗體重鏈、輕鏈，不作為選擇條帶。選擇與AGPS 條帶有區別并且其趨勢與AGPS 沉默后趨勢一致的蛋白條帶，切膠后送質譜檢測，篩選與AGPS 相互作用的蛋白。取免疫共沉淀樣品進行質譜測試，180 kD 處篩選出72 個潛在蛋白。將篩選獲得的數據進行整理，初步判斷HNRNPK 為AGPS的靶蛋白。在AGPS抗體免疫共沉淀的細胞裂解物中可同時檢測到AGPS 蛋白、HNRNPK 蛋白，表明AGPS 與HNRNPK可形成復合體，二者均在細胞核中表達。

2.3 同源模建結果 序列比對結果見圖1，其序列一致性和相似性分別為35.5%、37.5%。應用Discovery studio v3.5 中的“Build Homology Models”模塊，得到2 個HNRNPK 蛋白三維結構分別為Model 1、Model 2。模型的PDF Total Energy、DOPE Score 分數越低，模型質量越可靠，表明該模型在同源約束條件下優化的越好。根據以上原則選取Model 1 為最終模建結果。

圖1 HNRPK蛋白序列與2JZX、1b25、1khm模板序列比對

選取100個構象對氨基酸結構的合理性進行Ramachandran plot評估，結果表明該同源模型有90.31%的氨基酸殘基落在“最適區”，4.73%的氨基酸殘基落在“一般允許區”，4.96%的氨基酸殘基落在psi-phi構象不合理區域，說明構象已達到最優模型的標準，這一蛋白模型的骨架結構合理，見圖2A。將上述得到HNRNPK蛋白的最優構象使用Profile-3D對氨基酸結構的合理性進行評估。模建結構的Verify Score 為164.8 分，高于Verify Expected Low Score（87.062 3分），并且與Verify Expected High Score（193.472分）接近，見圖2B。說明其蛋白模型可信度較高，蛋白中氨基酸結構均合理，可以作為蛋白-蛋白對接的起始構型。

圖2 HNRPK蛋白三維立體結構的同源模建

2.4 蛋白間模擬對接結果 應用ZDOCK 和RDOCK 方法得到HNRNPK 與AGPS 的模擬復合物結構。應用superimpose 程序將AGPS 蛋白與晶體庫中已有蛋白的構象進行疊合，獲取目標對象分析HNRNPK 蛋白與AGPS 蛋白結合界面處關鍵氨基酸殘基的相互作用，預測HNRNPK 蛋白與AGPS 蛋白的結合位點。

HNRNPK-AGPS 復合物相互作用界面處共含有7 個氫鍵和2 個Pi 鍵相互作用來維持其三維結構的穩定。HNRNPK：Lys139：NZ 和AGPS：Phe559 的苯環形成Pi-Sigma相互作用；HNRNPK：Phe181的苯環和AGPS：Lys147：NZ 形成Pi-Cation 相互作用。結合界面處有四對氨基酸殘基（GLY83：HN-ASN139：OD1，CYS185：HG-LYS147：O，CYS184：SG-ALA148：HN，LYS219：O-SER589：HG）間的氫鍵鍵長均小于2.7?，屬于短強氫鍵，是穩定HNRNPK-AGPS 復合物結構的主要作用力。HNRNPK-AGPS 復合物疏水性氨基酸殘基的分布圖顯示，HNRNPK 蛋白中氨基酸殘基表現出了疏水性質，使兩蛋白間形成了較強的疏水界面。靜電相互作用分析顯示，HNRNPK 的氨基酸殘基形成的正電勢區域和AGPS 的氨基酸殘基形成的負電勢區域形成靜電互補，HNRNPK 的氨基酸殘基形成的負電勢區域和AGPS 的氨基酸殘基形成的正電勢區域形成靜電互補。

計算結果顯示HNRNPK蛋白和AGPS蛋白的總相互作用能為-54.559 3 kCal/mol，其中范德華作用能和靜電作用能分別為-17.706 1、-42.047 2 kCal/mol，靜電作用能大于范德華作用能，說明靜電作用是促使復合物結構形成的主要驅動力，之間的相互作用能對HNRNPK-AGPS復合物活性區域結構的穩定起重要作用。

3 討論

神經膠質瘤細胞浸潤到正常腦組織，可破壞正常腦組織功能，早期可表現為局限性癲癇等刺激癥狀，后期則表現為癱瘓等神經功能缺失癥狀，是神經膠質瘤惡化的標志以及治療失敗和死亡的主要原因。異常表達的脂質可通過參與腫瘤細胞構成以及信號轉導過程，調控一系列功能基因異常開啟和（或）關閉，使得腫瘤細胞獲得不同于正常細胞的多種特性，誘導細胞癌變以及腫瘤惡性增殖、侵襲和凋亡抵抗等［7-8］。

AGPS 失活可降低腫瘤細胞中醚脂、前列腺素和酰基磷脂等對腫瘤細胞生長和擴散至關重要的多種脂質表達，同時降低癌癥致病性，而AGPS 過表達則可增加多種腫瘤細胞（乳腺癌231MFP 細胞、黑素瘤C8161 細胞、前列腺癌PC3 細胞及原發性乳腺癌細胞等）的生存和運動能力，促進腫瘤的生長和侵襲［9-11］。因此，AGPS 可能是潛在的神經膠質瘤診斷和治療靶點。本課題組之前研究也表明，沉默AGPS 表達可抑制神經膠質瘤細胞體外增殖和侵襲，因此在此研究中繼續深入研究AGPS的靶蛋白。

本研究選取神經膠質瘤U251 細胞，通過Co-IP和質譜技術確定了AGPS 可直接作用于HNRNPK。HNRNPK 是一種癌基因，在多種腫瘤中異常表達。其與腫瘤增殖和脂質代謝密切相關，沉默其表達可降低腫瘤的惡性程度［12-14］。

分析HNRNPK 蛋白與AGPS 蛋白的結合方式及相互作用的氨基酸殘基，可為后續研究HNRNPK 蛋白與AGPS 的相互作用奠定了基礎。本實驗采用同源建模技術構建了HNRNPK 蛋白的三維結構，得到了模型1 和模型2 的兩種構象。其中模型1 的PDF總能量和DOPE 得分較低，說明模型質量可靠，可以作為最終的建模結構。由于得到的模型結構在空間上可能不合理，本文采用分子動力學方法對其進行了優化，提取了100個構象，用Ramachandran圖對氨基酸結構的合理性進行了評價。得到了HNRNPK蛋白的最佳構象，90.31%的氨基酸殘基落在“最佳區”。進一步利用Profile-3D 對氨基酸結構的合理性進行評價，結果表明蛋白質模型可信度高，蛋白質中氨基酸結構合理，可以作為蛋白質-蛋白質對接的起始構型。ZDOCK 和RDOCK 方法被用來模擬兩種蛋白質之間的相互作用。根據Eèu DOCK 得分排名，Pose1 得分最低，可能是最接近真實構象的對接構象。將Pose1 中AGPS 蛋白的構象與晶體庫中蛋白質的構象疊加后，RMSD 值小于1?，表明其構象接近真實結構的構象。通過分析氫鍵相互作用、共軛相互作用、疏水相互作用、靜電相互作用和相互作用能，發現靜電相互作用能明顯大于范德華相互作用能。HNRNPK-AGPS 復合物的結合模式和相互作用的氨基酸殘基預計位于HNRPK 的結合界面（Gly83、Lys139、Thr177、Phe181、Cys184、Cys185、Lys219）以及AGPS 的結合界面（ASN139、LYS147、ALA148、SER149、PHE559、SER589）。其中，4 對氨基酸殘基（GLY83：HN-ASN139：OD1、CYS185：HG-LYS147：O、CYS184：SG-ALA148：HN、LYS219：O-SER589：HG）氫鍵長度均小于2.7?，為短而強的氫鍵，對維持蛋白質三維結構的穩定性非常重要。HNRNPK苯環上的Lys139和AGPS的Phe559形成了西格瑪π 鍵，HNRNPK 苯環上的Phe181 和AGPS：Lys147形成陽離子π鍵，維持了HNRPK和AGPS相互作用的穩定性。HNRPK蛋白與AGPS蛋白的疏水比為45.53%，表明兩者之間形成了一個強疏水界面。

以上分析揭示了HNRPK蛋白和AGPS蛋白的結合方式和相互作用的氨基酸殘基，HNRNPK-AGPS復合物具有明顯的正負互補電位。可見這些氨基酸之間的相互作用主要是氫鍵和共軛作用。