不同碳源對耐熱型解脂亞羅酵母生長的影響

夏 凱,邵惠聰,陳珊珊,彭艷婷,黃 俊

(1.浙江科技大學 生物與化學工程學院,杭州 310023;2.浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室,杭州 310023;3.浙江省農業生物資源生化制造協同創新中心,杭州 310023)

赤蘚糖醇(erythritol)化學名為(2R,3S)-butane-1,2,3,4-丁四醇,是一種白色、無味、不吸濕、無光學活性、熱穩定性好及易溶于水的四碳醇,廣泛存在于水果、蔬菜和發酵食品中[1-2]。近年來,赤蘚糖醇憑借其獨特的理化性質如熱值低、基本上不被人體代謝、穩定性高和食用不會引起腸道不適等受到廣泛關注,市場需求量持續增長。據預測,到2025年,其市場需求將達到48.9萬t左右[3-4]。

目前,赤蘚糖醇主要由解脂亞羅酵母以葡萄糖和淀粉為原料進行發酵生產,存在生產成本高、冷卻能耗大及生產效率低等問題[5]。在國家“雙碳”目標背景下,實現赤蘚糖醇綠色生產勢在必行。其中,如何有效降低生產成本一直備受關注。高溫發酵能夠實現糖化和發酵過程同步進行,并且降低冷卻能耗及染菌倒灌風險,是降低生產成本的重要途徑[6-8]。高溫發酵需要使用能夠耐受熱脅迫的菌株,這與解脂亞羅酵母最適生長溫度(30 ℃)相悖。

適應性進化可獲得耐熱型菌株,然而有研究[9]表明高溫脅迫可能會改變菌株的碳源利用譜。同時,在耐熱型解脂亞羅酵母選育過程中,研究者發現熱脅迫抑制細胞代謝合成赤蘚糖醇[10]。因此,如何提高細胞在高溫條件下的赤蘚糖醇合成能力值得探索。本課題組前期通過適應性實驗室進化結合誘變選育,已獲得能夠在不同溫度條件下生長的解脂亞羅酵母菌株。基于已有耐熱型菌株,本研究旨在探明不同碳源對這些菌株生長及產赤蘚糖醇的影響;并在此基礎上,通過改變培養基中碳源組分提高赤蘚糖醇產量,為今后高溫發酵生產赤蘚糖醇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤蘚糖醇高產菌種解脂亞羅酵母CA20由實驗室選育獲得,生長溫度為30 ℃,現保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC: M2022880)[11]2。耐熱型解脂亞羅酵母HT34和HT38,生長溫度分別為34 ℃和38 ℃,保藏于浙江科技學院生物與化學工程學院生物工程實驗室。

試驗中所用化學試劑,如無特殊說明,均為分析純,采購于生工生物工程(上海)股份有限公司及國藥集團化學試劑有限公司。大豆油脂(金龍魚)購買于本地靈峰生活超市(浙江益海嘉里食品工業有限公司)。碳源包括單糖(葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖)、二糖(麥芽糖、蔗糖和纖維二糖)、糖醇(甘露醇和山梨醇)及其他物質(甘油、可溶性淀粉和大豆油脂),均購于國藥集團化學試劑有限公司。

菌種活化培養基(yeast extract peptone dextrose medium,YPD):D-葡萄糖,質量濃度為20 g/L;酵母浸出粉(oxoid),質量濃度為10 g/L;蛋白胨(oxoid),質量濃度為5 g/L;NaCl,質量濃度為10 g/L;KH2PO4,質量濃度為0.5 g/L;培養基溶液的pH值為6.0。固體培養基在液體培養基基礎上添加質量濃度為20 g/L的瓊脂粉。

試驗中除碳源質量濃度變化外,其他培養基組分濃度保持不變。生長曲線測定過程中,碳源質量濃度統一為10 g/L。赤蘚糖醇發酵試驗中,葡萄糖質量濃度改為200 g/L。

1.2 主要儀器

全波長多功能酶標儀SpectraMax iD3(美谷分子儀器(上海)有限公司)、臺式高速冷凍離心機Allegra64R(美國貝克曼庫爾特有限公司)、智能恒溫搖床ZQZY-78AE(溫度調節精度±0.1 ℃)(上海知楚儀器有限公司)、高效液相色譜儀e2695(美國沃特世公司)、Aminex HPX-87H分析柱(300 mm×7.8 mm)(美國伯樂公司)、示差折光檢測器2414(美國沃特世公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 生長曲線測定

將甘油管保存的菌種CA20、HT34和HT38(-80 ℃)在固體活化培養基中進行劃線,之后分別置于30、34、38 ℃條件下靜置培養3 d。挑取單菌落接種于5 mL YPD,200 r/min振蕩培養至菌液光密度值(optical density, OD600)為3.0±0.5。之后以體積分數1%的比例轉接于40 mL新鮮的待測試培養基中,分別置于30、34、38 ℃條件下,200 r/min振蕩培養。培養過程中每隔24 h取樣測定菌液的OD600。根據單一糖組分試驗結果,測試混合碳源對不同菌株生長的影響。

1.3.2 赤蘚糖醇發酵試驗

挑取不同菌種的單菌落于5 mL YPD中進行過夜活化培養,之后以體積分數5%的比例接種于40 mL發酵培養基中進行為期5 d的連續培養,培養溫度分別為30 ℃(CA20)、34 ℃(HT34)和38 ℃(HT38),轉速為200 r/min,發酵結束后取樣測定發酵液中赤蘚糖醇和葡萄糖的質量濃度。赤蘚糖醇得率(g/g)=獲得的赤蘚糖醇質量/消耗的葡萄糖質量。發酵培養基中碳源為葡萄糖或葡萄糖和大豆油脂,大豆油脂質量濃度分別為10 g/L(大豆油脂1)和20 g/L(大豆油脂2)。

1.3.3 赤蘚糖醇及葡萄糖檢測

產物和底物濃度測定采用高效液相色譜(HPLC),參照文獻[11]3所述。取樣后,離心收集上清液(8 000 r/min,5 min),過0.22 μm濾膜,保存于-20 ℃備用。檢測條件為柱溫35 ℃,進樣量為10 μL,流動相是摩爾濃度為0.5 mmol/L的硫酸,流速為0.6 mL/min。

1.3.4 數據統計分析

本研究中所涉及生物學試驗均重復3次以上,數據差異顯著性分析采用Origin 9.0軟件中的ANOVA分析方法[12],選用Bonferroni多重比較,p<0.05為兩組數據間差異顯著。圖片處理采用軟件Adobe Illustrator CC 2022。

2 結果與討論

2.1 解脂亞羅酵母在單一碳源培養基中的生長

解脂亞羅酵母CA20在單一碳源培養基中的生長曲線如圖1所示。試驗結果顯示,在選取的5種單糖、3種二糖、2種糖醇和3種其他物質中,菌株CA20均能對它們進行利用。其中,相比半乳糖、阿拉伯糖和木糖等單糖,CA20更易利用果糖和葡萄糖(圖1(a))。CA20在添加麥芽糖、蔗糖或纖維二糖的培養基中生長緩慢(圖1(b)),說明菌株CA20對二糖的利用能力較弱。培養基中添加甘露醇可明顯促進細胞的生長,而添加山梨醇時細胞的生長效果類似于在培養基中添加葡萄糖(圖1(c))。此外,CA20對淀粉的利用能力較弱,細胞生長緩慢,而添加大豆油脂可明顯促進其細胞生長(圖1(d))。

圖1 解脂亞羅酵母CA20的生長曲線Fig.1 Growth curves of Yarrowia lipolytica CA20

已有研究表明,解脂亞羅酵母具有較廣泛的底物譜,可利用烷烴、烯烴、有機酸、脂肪酸、甘油三酯、葡萄糖、甘油和果糖等[13]。類似地,本研究發現,解脂亞羅酵母CA20能很好地利用葡萄糖、果糖、甘露醇、山梨醇、甘油和大豆油脂進行生長。解脂亞羅酵母基因組中含有豐富的多糖水解酶編碼基因,然而研究發現其并不能直接利用淀粉和纖維素等多糖,以及木糖和蔗糖[14-15]。這可能是相應酶未被激活。本研究發現,菌株CA20能部分利用木糖、蔗糖、可溶性淀粉及纖維二糖進行生長,表明不同解脂亞羅酵母間存在差異。可見,菌株CA20具有較強的工業應用潛力。

解脂亞羅酵母HT34在單一碳源培養基中的生長曲線如圖2所示。試驗結果顯示,菌株HT34利用果糖和葡萄糖生長時,生長速率低于菌株CA20(圖2(a))。菌株HT34對半乳糖和木糖的利用優于菌株CA20。在二糖利用方面,菌株HT34利用纖維二糖和麥芽糖進行生長的情況類似菌株CA20(圖2(b))。此外,HT34對甘露醇和山梨醇的利用能力明顯下降(圖2(c))。類似現象同樣出現在HT34對甘油和可溶性淀粉的利用上(圖2(d))。另外,菌株HT34可利用大豆油脂進行較好的生長。菌株HT34是以解脂亞羅酵母CA20為基礎,通過適應性進化選育獲得的能在34 ℃條件下生長的耐熱型解脂亞羅酵母。以上結果表明,經過耐熱適應性進化,菌株HT34的底物利用譜發生了變化,這與已有研究結果一致[9]。

圖2 解脂亞羅酵母HT34的生長曲線Fig.2 Growth curves of Yarrowia lipolytica HT34

解脂亞羅酵母HT38在單一碳源培養基中的生長曲線如圖3所示。試驗結果顯示,解脂亞羅酵母HT38不能利用除葡萄糖以外的其他單糖,同時生長存在更長的延滯期(圖3(a))。對于麥芽糖、纖維二糖和蔗糖,HT38則完全不能利用(圖3(b))。此外,菌株HT38同樣不能利用山梨醇,而在含有甘露醇的培養基中培養延滯期高達48 h(圖3(c))。類似地,菌株HT38不能利用甘油和可溶性淀粉,但可以利用大豆油脂進行較好的生長(圖3(d))。

圖3 解脂亞羅酵母HT38的生長曲線Fig.3 Growth curves of Yarrowia lipolytica HT38

綜上所述,菌株CA20在耐熱適應性進化過程中碳源利用譜發生變化。隨著溫度的升高,細胞逐漸失去了對葡萄糖以外的單糖、二糖、糖醇及甘油和可溶性淀粉利用的能力。這可能由兩方面原因導致:首先,耐熱菌株選育過程以葡萄糖作為唯一碳源;其次,熱脅迫抑制了細胞中涉及其他碳源代謝酶的活性。值得注意的是,耐熱型解脂亞羅酵母可利用大豆油脂進行較好的生長。

2.2 解脂亞羅酵母在混合碳源培養基中的生長

組合碳源對不同菌株生長的影響如圖4所示。試驗結果顯示,相比單獨添加葡萄糖,培養基中同時添加葡萄糖和甘露醇、山梨醇或果糖對菌株CA20的生長無明顯影響,而同時添加葡萄糖和甘油對CA20的生長產生抑制作用(圖4(a))。對于菌株HT34,同時添加葡萄糖和山梨醇或果糖對其生長無明顯影響,而添加葡萄糖和大豆油脂可促進其在48 h前的生長(圖4(b))。類似地,培養基中同時添加葡萄糖和大豆油脂可促進菌株HT38的生長(圖4(c))。綜上可知,培養基中加入大豆油脂有利于耐熱型解脂亞羅酵母的生長,這與使用單一碳源的結果類似。已有研究表明,通過改變細胞膜脂質組分提升細胞結構穩定性是酵母菌抵御熱脅迫的重要策略[16]。大豆油脂中含有豐富的脂肪酸成分,因此培養基中添加大豆油脂可為細胞提供豐富的脂肪酸,進而有利于細胞在熱脅迫環境中生長。

圖4 不同菌株在組合碳源培養基中的生長曲線Fig.4 Growth curves of different strains at media with combined carbon sources

2.3 大豆油脂對耐熱型解脂亞羅酵母產赤蘚糖醇的影響

不同菌株在含大豆油脂培養基中的赤蘚糖醇產量和得率如圖5所示。試驗結果顯示,添加10 g/L大豆油脂對菌株CA20的赤蘚糖醇產量無明顯促進作用(p>0.05)(圖5(a))。添加20 g/L大豆油脂時赤蘚糖醇產量為66.52 g/L,顯著高于不添加大豆油脂時的53.81 g/L和添加10 g/L大豆油脂時的54.87 g/L。在不添加大豆油脂的情況下,菌株HT34的赤蘚糖醇產量為42.33 g/L,低于菌株CA20的產量,表明熱脅迫抑制細胞代謝合成赤蘚糖醇。這與已有的研究報道類似[17]。添加10 g/L和20 g/L的大豆油脂可顯著提升菌株HT34的赤蘚糖醇產量至47.67 g/L和55.67 g/L(圖5(b))。類似結果同樣出現在菌株HT38中,添加20 g/L的大豆油脂可提升HT38的產量至29.67 g/L,顯著高于不添加大豆油脂時的20.5 g/L,產量增加比例達44.73%(圖5(c))。

注:*表示p<0.05;**表示p<0.01;***表示p<0.001。

相比產量,添加大豆油脂并不能明顯提升菌株CA20的赤蘚糖醇得率(圖5(a)),然而添加20 g/L的大豆油脂可顯著提升菌株HT34和HT38的赤蘚糖醇得率(圖5(b)和(c))。添加20 g/L的大豆油脂時,菌株HT34和HT38的赤蘚糖醇得率分別為0.53 g/g和0.38 g/g,顯著高于未添加時的0.43 g/g和0.32 g/g,增加比例分別為23.26%和18.75%。綜上可知,耐熱型解脂亞羅酵母的赤蘚糖醇產量和得率低于常溫菌株CA20,培養基中添加大豆油脂可顯著提升耐熱型解脂亞羅酵母的赤蘚糖醇產量。

3 結 語

本研究探索了不同碳源對耐熱型解脂亞羅酵母生長及代謝合成赤蘚糖醇的影響。試驗結果表明,適應性進化過程中,耐熱菌株逐漸失去對除葡萄糖和大豆油脂以外的單糖、二糖、糖醇及甘油和可溶性淀粉的利用能力。組合添加葡萄糖和大豆油脂可顯著促進耐熱菌株HT34和HT38的生長及赤蘚糖醇合成,其中赤蘚糖醇產量和得率的增加量最大可達44.73%和23.25%。本研究結果為今后利用高溫發酵生產赤蘚糖醇提供了理論依據。