局部晚期食管癌患者血清miR-193b、miR-330-5p水平與新輔助放化療療效的關系

胡芳，方向東，付江萍，伍桂容，殷錕鵬，杜林娟

達州市中心醫院腫瘤內科，四川達州 635000

食管癌是起源于食管上皮的惡性腫瘤，臨床以進行性吞咽困難為進展期典型癥狀［1］。多數食管癌患者早期無明顯特異性癥狀，確診時已為局部晚期，僅靠單純手術無法根治。新輔助放化療后手術為局部晚期食管癌患者的首選治療方案，相對于單純手術，術前行新輔助放化療能有效縮小腫瘤體積，提高手術效果，改善患者預后［2］。但由于受到細胞氧合、基因等因素的影響，食管癌患者對放化療的反應存在差異［3］。因此，尋找可評估局部晚期食管癌患者新輔助放化療療效的血清標志物對指導臨床治療具有積極意義。微小RNA（miRNA）為內源性非編碼RNA，能通過調控靶基因實現對腫瘤的調控，從而在腫瘤發生發展、轉移過程及放化療敏感性中發揮重要作用［4］。多項研究顯示，miR-193b、miR-330-5p 在惡性腫瘤的發生發展、轉移過程中發揮抑癌基因作用。miR-193b 是位于人16p13、12 的非編碼小分子RNA，有研究顯示其可抑制腫瘤細胞的增殖能力［5］。miR-330-5p 是與細胞侵襲及增殖等有關的非編碼RNA，在多種組織器官的惡性生物學過程中發揮重要作用［6］。目前，關于miR-193b、miR-330-5p 對惡性腫瘤放化療療效影響的研究相對較少。基于此，本研究觀察了血清miR-193b、miR-330-5p 水平與局部晚期食管癌患者新輔助放化療臨床療效的關系，旨在為食管癌的臨床治療提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經達州市中心醫院醫學倫理委員會批準（2018012），收集2018年1月—2020年3月本院收治的局部晚期食管癌患者。納入標準：①符合《中國早期食管癌篩查及內鏡診治專家共識意見》中食管癌的診斷標準［7］，且經影像學、組織病理學檢查確診為食管癌；②美國癌癥聯合會TNM 分期為T3～T4/N1～N2/M0；③接受新輔助放化療；④卡氏評分≥70 分；⑤至少有一處可測量的病灶；⑥臨床病理資料和隨訪資料完整；⑦患者及家屬均簽署知情同意書。排除標準：①合并重要臟器功能衰竭；②合并消化道出血、嚴重感染；③放化療不耐受；④合并其他惡性腫瘤；⑤妊娠或哺乳期婦女；⑥伴食管氣管瘺。共收集符合上述標準的局部晚期食管癌患者180例，其中男97 例、女83 例，年齡22～75（55.46 ±7.82）歲，病理類型鱗癌152例、腺癌28例。

1.2 血清miR-193b、miR-330-5p 檢測方法 采用qRT-PCR 法。所有納入患者放化療前取空腹靜脈血，離心分離血清。使用TRIzol 試劑盒（張家口賽諾生物科技有限公司）提取血清總RNA，微量分光光度計（上海科那美科學儀器有限公司）驗證其純度與濃度，使用反轉錄試劑盒合成cDNA。以cDNA 作為模板，按SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（北京智杰方遠科技有限公司）行PCR擴增，引物合成與序列測定由上海基康生物技術有限公司完成。反應條件：95 ℃ 90 s、95 ℃ 30 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s，共循環40 次。引物序列：miR-193b 上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGAACTGGCCCTCAAAGT-3′，下游引物5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；miR-330-5p 上游引物5′-GCCTCTCTGGGCCTGTTGTC-3′，下游引物5′-CAGTGCAGGGTCCGAGG-3′；U6 上游引物5′-CGTCGACGTGCATGCACG-3′，下游引物5′-GCTTAAGCTAGCTAGCGC-3′。以U6 為內參，按2-ΔΔCt法計算miR-193b、miR-330-5p 相對表達量。

1.3 新輔助放化療及療效評價方法 放療前通過電子計算機斷層掃描掃描定位，層厚為5 mm；確認靶區，計劃靶體積，劑量在40～50 Gy，每次2 Gy，每周治療5 次，期間采用醫用直線加速器（美國Varian公司）進行放療。放療計劃開始同步第1 天行新輔助化療，順鉑聯合5-氟尿嘧啶方案：第1～3 天以75 mg/m2標準的順鉑靜脈滴注，第1～5 天靜脈滴注500 mg/m2的5-氟尿嘧啶，21 d 為一化療周期，患者持續化療2 周期。新輔助放化療4～6 周后評估分期，再針對性對患者進行手術治療。于治療后參考《實體瘤治療療效評價標準—RECIST》［8］評估放化療療效。所有目標病灶消失，無新病灶出現，且維持4 周以上為完全緩解（CR）；所有目標病灶最長徑總和下降≥30%，且維持4 周以上為部分緩解（PR）；最小目標病灶最長徑總和增加≥20%，或出現一個或多個新病灶為疾病進展（PD）；所有目標病灶最長徑總和縮小但未達到PR 或增加未達到PD 為穩定（SD）。將CR+PR 者定義為放化療有效者，SD+PD 者定義為放化療無效者。

1.4 統計學方法 采用SPSS25.0 統計軟件。計量資料使用K-S 法進行正態性檢驗，符合正態分布的以表示，組間比較采用t檢驗；非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗；比較新輔助放化療有效與無效的局部晚期食管癌患者臨床資料，取有統計學差異的臨床資料進一步納入多因素Logistic 回歸分析。采用多因素Logistic 回歸分析局部晚期食管癌患者新輔助放化療無效的影響因素，并通過繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析血清miR-193b、miR-330-5p 對局部晚期食管癌患者新輔助放化療無效的預測價值。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 局部晚期食管癌患者新輔助放化療療效評價結果 180 例局部晚期食管癌患者行新輔助放化療后CR 22 例、PR 62 例、SD 78 例、PD 18 例；放化療有效者共84例、無效者共96例。

2.2 血清miR-193b、miR-330-5p 水平與局部晚期食管癌新輔助放化療療效的關系 新輔助放化療有效的局部晚期食管癌患者中男48 例、女36 例，年齡（55.13 ± 7.19）歲，病理類型為鱗癌69 例、腺癌15例、腫瘤直徑＜5 cm 42 例、≥5 cm 42 例，腫瘤位置為頸段與胸上段47 例、胸中段與胸下段37 例，腫瘤分化程度為低分化9例、中分化12例、高分化63例，腫瘤T 分期為T3期39 例、T4期45 例，腫瘤N 分期為N1期61 例、N2期23 例，血清miR-193b 為7.48 ± 1.25，血清miR-330-5p 為2.03 ± 0.26；放化療無效的局部晚期食管癌患者中男49 例、女47 例，年齡（55.75 ±7.44）歲，病理類型為鱗癌83 例、腺癌13 例、腫瘤直徑＜5 cm 40 例、≥5 cm 56 例，腫瘤位置為頸段與胸上段59 例、胸中段與胸下段37 例，腫瘤分化程度為低分化23 例、中分化25 例、高分化48 例，腫瘤T 分期為T3期37 例、T4期59 例，腫瘤N 分期為N1期38 例、N2期58 例，血清miR-193b 為1.67 ± 0.44，血清miR-330-5p 為0.30 ± 0.14。新輔助放化療有效與無效的局部晚期食管癌患者腫瘤分化程度、腫瘤N分期、血清miR-193b、血清miR-330-5p 比較差異均有統計學意義（P均＜0.05）。以上述有統計學差異的因素為自變量，以局部晚期食管癌患者新輔助放化療是否有效為因變量，納入多因素Logistic 回歸分析。賦值：放化療無效=1、放化療有效=0，腫瘤高分化=0、中分化=1、低分化=2，腫瘤N 分期N1期=0、N2期=1，血清miR-193b、miR-330-5p 水平為原值連續性輸入。多因素Logistic回歸分析結果顯示，低血清miR-193b、低血清miR-330-5p 是局部晚期食管癌患者新輔助放化療無效的獨立危險因素（P均＜0.05）。見表1。

表1 局部晚期食管癌患者新輔助放化療無效的多因素Logistic回歸分析結果

2.3 血清miR-193b、miR-330-5p水平對局部晚期食管癌患者新輔助放化療無效的預測價值 ROC曲線分析結果顯示，血清miR-193b、血清miR-330-5p預測局部晚期食管癌患者新輔助放化療無效的AUC依次為0.752、0.777，兩項指標聯合預測局部晚期食管癌患者新輔助放化療無效的AUC為0.829。見表2。

表2 血清miR-193b、miR-330-5p水平對局部晚期食管癌患者新輔助放化療無效的預測價值

3 討論

對局部晚期食管癌患者，新輔助放化療后手術為首選標準治療方案［9］。新輔助放化療為局部晚期食管癌治療的有效方式，術前新輔助放化療能消除或控制潛在微小病灶，提高放射治療的敏感性，縮短治療時間，并能不同程度減輕腫瘤負荷與組織反應性水腫，提高手術切除率。相較于單純手術，術前新輔助放化療能有效改善患者生存質量，但也存在部分患者療效不佳［10］。miRNA 普遍存在于生物體內，為高度保守的單鏈非編碼小分子RNA，是轉錄、轉錄后基因沉默的關鍵調控基因，與多種生物學過程有關［11］。miRNA 可通過調控靶基因來影響腫瘤細胞對藥物的吸收和代謝，進而調控化療敏感性及放療抵抗［12］。

miR-193b 編碼基因位于人16 號染色體，參與多種病理生理過程，在多種惡性腫瘤發生發展中發揮負調控作用，是腫瘤抑制因子［13］。本研究結果顯示，行新輔助放化療有效的局部晚期食管癌患者血清miR-193b 水平高于放化療無效患者。其原因可能為miR-193b 在食管癌中發揮抑癌基因作用，其高水平可抑制食管癌細胞增殖，而水平下調則可能激活促癌機制，導致腫瘤發生發展、侵襲轉移等惡性行為，增強食管癌細胞對放化療的敏感性［14］。miR-330-5p 為癌癥相關的基因，在肺癌［15］、結直腸癌［16］、腦膠質瘤［17］、胰腺癌［18］中低表達，在惡性腫瘤中發揮抑癌作用。本研究結果顯示，行新輔助放化療有效的局部晚期食管癌患者血清miR-330-5p 水平高于放化療無效患者，分析其原因可能為miR-330-5p 低水平能促進腫瘤組織增殖、侵襲等惡性過程，增加食管癌患者對新輔助放化療反應性降低的風險，從而影響放化療療效［19］。

本研究多因素Logistic 回歸分析結果顯示，低血清miR-193b、低血清miR-330-5p 是局部晚期食管癌患者新輔助放化療無效的獨立危險因素；ROC曲線分析結果顯示，血清miR-193b、miR-330-5p聯合預測局部晚期食管癌患者新輔助放化療無效的AUC 為0.829，敏感度與特異度分別為0.844、0.821，提示血清miR-193b、miR-330-5p 對局部晚期食管癌新輔助放化療療效具有一定預測價值，兩者聯合檢測的預測效能高于單獨檢測。

綜上所述，行新輔助放化療有效的局部晚期食管癌患者血清miR-193b、miR-330-5p 水平高于放化療無效的患者，血清miR-193b、血清miR-330-5p 低水平是局部晚期食管癌患者新輔助放化療無效的獨立危險因素，兩者聯合對局部晚期食管癌新輔助放化療療效具有一定預測價值，可作為新輔助放化療療效評估的生物學標志物。