補氣通竅方灌胃對大鼠變應性鼻炎的治療作用及其機制

陳俊峰，王明剛，桂雄斌

廣西中醫藥大學第一附屬醫院耳鼻喉科，南寧 530000

變應性鼻炎（AR）是一種常見變態反應性疾病，是由特異性免疫球蛋白E（IgE）介導的鼻黏膜慢性炎癥反應，以發作性噴嚏、鼻溢、鼻塞、鼻癢等為典型臨床癥狀［1-2］。目前AR 的常規治療方法包括藥物治療、免疫治療及手術治療［3］，在此基礎上還有單克隆抗體治療及間充劑干細胞等新興療法［4］，但一線用藥無法有效降低復發率，免疫治療依從性較差，手術治療接受率低，新興療法運用到臨床還需較長時間。深入認識AR 的相關機制，從而形成有效的防治策略具有重要意義。腸道微生態是以腸道菌群為主要成分的自平衡系統，與多種免疫損傷性疾病密切相關。多項研究表明，AR的發生發展與胃腸道微生態的改變有關［5-9］。AR 在中醫學上被稱為鼻鼽或齁嚏［10］。本課題組認為，體質差異導致的肺脾氣虛，易受外邪侵擾，邪氣淤積終至氣機受阻于鼻竅是AR的病因機制。根據氣竅一體理論，結合脾主運化中醫基礎，課題組提出健脾中藥補氣通竅方。通過前期研究觀察發現，補氣通竅方能有效緩解AR 患者鼻炎癥狀，且總有效率高于對照組［11］。腸道微生態是中藥復方發揮療效作用的主要途徑之一，因此課題組推測補氣通竅方可能通過調節腸道微生態進而改善AR。2022 年11 月—2023 年7 月，本研究通過構建大鼠AR 模型，探討補氣通竅方對大鼠AR 癥狀的改善作用以及對腸道微生態的潛在調節作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPF 級健康Wistar大鼠40只，6～8周齡，體質量約250 g，購于湖南省長沙市天勤生物技術有限公司，動物使用許可證號：SCXK（湘）2019-0014。補氣通竅方中藥配方顆粒劑（黃芪20 g、黨參12 g、甘草12 g、蒼耳子20 g、辛夷花10 g、細辛3 g、荊芥15 g、桔梗10 g、升麻10 g、柴胡10 g）由江陰天江（廣州）藥業有限公司提供，鼻炎康片（德眾）購于廣西中醫藥大學第一附屬醫院。卵清蛋白購于美國Sigma公司，β-actin、NF-κB p65抗體購于美國Affinity公司。生物顯微鏡購于日本奧林巴斯，測序儀、建庫試劑盒NEB Next?Ultra DNA Library Prep Kit 購于美國Illumina 公司，PCR 產物純化Universal DNA 純化回收試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 動物分組建模與藥物干預 40 只Wistar 大鼠按隨機數字表法分為對照組、模型組、補氣通竅方組及鼻炎康組，每組10 只。除對照組外，各組均根據前期造模方式［12］建立大鼠AR 模型。將卵清蛋白、氫氧化鋁、生理鹽水按照0.3 mg、30 mg、1 mL 的比例充分混勻，腹腔注射，2 天1 次，共注射14 d、7 次；第15 天起，大鼠兩側鼻孔各滴50 μL 10%卵清蛋白溶液（生理鹽水配置），1天1次，共滴7 d、7次［13］。自第22 天起，模型組給予4 mL/d 純凈水灌胃，補氣通竅方組給予補氣通竅方57.55 g/（kg·d）灌胃［14］，鼻炎康組給予鼻炎康462.5 mg/（kg·d）灌胃，共灌胃7 d、7次；對照組常規喂養不灌胃。

1.3 動物行為學積分評價 各組每次灌胃結束后觀察記錄大鼠30 min 內抓鼻、噴嚏及流涕的癥狀發生情況并進行行為學評分。評分標準：30 min 內噴嚏1～3 次計1 分、4～10 次計2 分、≥11 次計3 分；抓鼻1～5 次計1 分、6～15 次計2 分、＞15 次計3 分；流涕流至鼻孔前計1 分、流出鼻孔前計2 分、涕流滿面計3 分。以疊加法統計動物行為學積分，總分越高代表鼻炎癥狀越重。

1.4 脾臟、結腸及鼻黏膜組織樣本采集 各組末次灌胃結束后禁食不禁水12 h，采用10%水合氯醛按3 mL/kg 劑量麻醉，以腹中線為切口暴露腹腔，腹主動脈采血，分離脾臟于凍存管中置于-80 ℃冰箱備檢。剪取近直腸端結腸組織約2 cm（包含至少2 粒糞便顆粒），保存于-80 ℃冰箱備檢。沿大鼠雙眼眶剪下鼻骨，鉗出鼻中隔，剝離鼻中隔兩側鼻黏膜組織，40 g/L多聚甲醛固定。

1.5 鼻黏膜組織病理學觀察 各組鼻黏膜組織采用多聚甲醛固定12 h以上，以50%、75%、95%、100%梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋后切片，厚度約5 μm。常規HE 染色，顯微鏡下觀察鼻黏膜纖毛狀態、腺體的病理改變及嗜酸性粒細胞等炎癥細胞的浸潤程度。

1.6 脾臟組織NF-κB p65 蛋白檢測 采用Western blotting 法。各組剪取少許脾臟組織并碾碎，加入蛋白裂解液充分裂解后于4 ℃離心機12 000 r/min 離心15 min 取上清液，配置BSA 標準品及BCA 工作液測定蛋白濃度。將所取蛋白變性后依次進行電泳、轉膜、一抗、二抗、顯色。采用BandScan 軟件分析條帶灰度值。

1.7 腸道菌群多樣性及豐度檢測 按照DNA 試劑盒說明書進行腸道內容物的細菌微生物基因組DNA 提取，將16 S rRNA 的V3～V4 區引物進行PCR 擴增后使用高通量測序儀Miseq 對其進行測序。統計各組包含的腸道菌群種類，采用偏最小二乘法判別分析法（PLS-DA）對各組腸道菌群進行判別分析；通過Beta 多樣性指數基于Bray Curtis距離、Weighted Unifrac 距離及Unweighted Unifrac距離，采用無度量多維標定法（NMDS）比較各組大鼠菌群結構差異。采用線性判別分析（LEfSe）法分析比較各組腸道微生態特定菌屬相對豐度的差異，設計LDA 效應值＞4 為豐度顯著差異物種。去掉極端值后，統計各組乳桿菌科相對豐度并進行比較。

1.8 統計學方法 采用SPSS24.0 軟件統計。計量資料采用Kolmogorov-Smirnov正態性檢驗，呈正態分布以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素ANOVA 檢驗，重檢驗復測量數據采用重復測量的方差分析；非正態分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組動物行為學積分比較 模型組、補氣通竅方組及鼻炎康組各時點動物行為學積分均高于對照組；灌胃2 d 后，補氣通竅方組動物行為學積分均低于模型組；灌胃3 d 后，鼻炎康組動物行為學積分均低于模型組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組動物行為學積分比較（分，）

表1 各組動物行為學積分比較（分，）

注：與對照組同時點比較，*P＜0.05；與模型組同時點比較，#P＜0.05。

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2.2 各組鼻黏膜組織病理學觀察結果 對照組鼻黏膜假復層纖毛柱狀上皮清晰可見，固有層無水腫、充血等病理改變；模型組鼻黏膜纖毛排列雜亂，可見纖毛脫落及倒伏現象，可見較多嗜酸性粒細胞等炎癥細胞浸潤，小血管明顯增生擴張，腺體數量明顯增加；補氣通竅方組及鼻炎康組固有層黏膜較為完整，炎癥細胞浸潤程度較模型組減少，無明顯腺體增生，鼻黏膜病理情況好轉。見OSID碼圖1。

2.3 各組脾臟組織NF-κB p65 蛋白表達比較 對照組、模型組、補氣通竅方組及鼻炎康組脾臟組織NF-κB p65 蛋白表達分別為1.00 ± 0.03、1.79 ±0.10、1.24 ± 0.11、1.33 ± 0.07，脾臟組織NF-κB p65 蛋白表達模型組＞補氣通竅方組、鼻炎康組，模型組＞對照組（P均＜0.05）。

2.4 各組腸道菌群多樣性及豐度比較 16 S rRNA 基因測序顯示，對照組、模型組、補氣通竅方組及鼻炎康組分別包含3 687、1 641、1 222、891 種菌群（OSID 碼圖2）。PLS-DA 分析顯示，各組大鼠腸道菌群分離，存在各自獨特的腸道菌群（OSID碼圖3）；NMDS 分析顯示，各組大鼠兩兩比較，組間菌群結構存在差異（P均＜0.05，OSID 碼圖4）。LEfSe 分析結果顯示，對照組中厚壁菌門及其分類下的乳桿菌目、乳桿菌科、乳桿菌屬、芽孢桿菌綱富集；模型組中梭菌綱、瘤胃球菌屬以及梭菌目富集；補氣通竅方組中擬桿菌目、擬桿菌綱、擬桿菌門富集；鼻炎康組中密螺旋體屬、螺旋體門、螺旋體綱、螺旋體目、螺旋體科以及普雷沃菌科富集；在菌屬水平上，各組大鼠的腸道菌群特定菌屬具有顯著差異（LDA＞4，OSID 碼圖5）。在科水平上，對照組、模型組、補氣通竅方組及鼻炎康組乳桿菌科相對豐度分別為58.35% ± 5.21%、36.57% ± 6.98%、50.76% ± 9.81%、47.06% ± 6.24%，乳桿菌科相對豐度對照組＞補氣通竅方組、鼻炎康組＞模型組（P均＜0.05）。

3 討論

中醫學認為，鼻與脾臟關系密切，鼻病的發生發展與脾臟功能改變有關。在中醫古籍中就有“鼻準屬脾土”“脾熱病者，鼻先赤”等記載，中醫對AR的治療常采用健脾益肺療法［15］。本課題組創新性提出氣虛竅阻的AR 病因機制，根據氣竅一體、脾主運化的治療思路創制中藥補氣通竅方。方中黃芪、甘草有益于脾肺之氣；辛夷花、蒼耳子在現代中醫常用作治療鼻疾病的藥物，有通鼻竅之妙用；細辛、荊芥、桔梗、升麻、柴胡具有驅寒升陽的作用；加之黨參、甘草的調和作用可健脾益氣。鼻炎康是治療AR 的常用藥物，其治療作用已被臨床證實，因此本研究選擇鼻炎康作為陽性對照藥物。本研究發現，灌胃治療過程中補氣通竅組及鼻炎康組大鼠動物行為學評分總體呈下降趨勢，兩組大鼠由于AR 所導致的抓鼻、噴嚏等行為均得到緩解。經補氣通竅方治療的AR 大鼠鼻黏膜病理損傷優于模型組，其黏膜完整性及炎癥細胞浸潤程度等病理情況明顯改善，改善效果與鼻炎康組基本一致，提示補氣通竅方可有效減輕大鼠AR 鼻黏膜病理改變，從而改善大鼠AR 癥狀。

AR 是由輔助型T 淋巴細胞1（Th1）/Th2 免疫應答失衡而引發的以鼻腔黏膜Th2 免疫反應為主的變應性炎癥反應，表現為大量表達Th2 細胞因子的Th 細胞、嗜酸粒細胞和肥大細胞浸潤，同時引發炎癥反應過程。有研究表明，TLR4/NF-κB 信號通路在AR 的發病過程中發揮重要作用［16］。作為一種轉錄因子，NF-κB 幾乎存在于所有細胞類型中，能與細胞核內的多種基因位點結合，促進該基因的轉錄表達，參與炎癥、免疫等生物學過程，是變態反應性疾病發生發展復雜網絡結構的中心環節。NF-κB活化后，可從細胞質進入細胞核，啟動一系列免疫相關反應，產生大量TNF-α、IL-4 等促炎因子，導致Th2 細胞增多并促進B 淋巴細胞的增殖分化，從而介導AR 的發生發展。NF-κB p65 是NF-κB 家族的重要成員之一，可以形成二聚體參與NF-κB 誘導過程，產生相應炎癥反應，與AR 的發病聯系緊密。本研究結果顯示，模型組脾臟組織NF-κB p65 蛋白表達高于對照組，而經過補氣通竅方治療后，補氣通竅方組脾臟組織NF-κB p65 蛋白表達較模型組降低，提示補氣通竅方可能通過抑制NF-κB p65 發揮對AR 的治療作用。

腸道菌群是定植在消化道中數以億計的微生物，包括細菌、真菌、古菌和病毒。腸道微生態暫未被明確定義，但其具備相對量較大的生物多樣性以及在某種水平上具有特定菌群的相對豐度。中醫學提出脾主運化及脾胃學說，與腸道微生態聯系緊密，調節腸道微生態是健脾中藥的治療本質之一，具有調節脾胃功能的中藥方可糾正腸道微生態［17］。NIEWIEM 等［18］發現腸道通透性增加與包括AR 在內的過敏性疾病密切相關，適當補充益生菌改善腸道屏障功能可以降低過敏性疾病的發生率。乳桿菌是一種公認的益生菌，研究發現其具備治療AR 的潛力，且對NF-κB p65 具有調節作用。多項研究表明，給予乳桿菌菌株可以對AR患者產生積極的影響，且尚未出現負面報道［19］。TRAPECAR 等［20］研究發現，部分乳桿菌成員可誘導觸發腸上皮細胞中NF-κB p65 易位，將該信號進一步轉化為吞噬細胞來促進免疫應答。KIM等［21］發現乳桿菌發酵甜菜根汁提取物可抑制脂多糖誘導的NF-κB p65 核易位，抑制NF-κB 信號通路中促炎細胞因子產生。本研究通過16 S rRNA 基因測序及PLS-DA 分析發現，各組大鼠均有各自獨特的腸道菌種；NMDS 分析結果顯示，各組大鼠兩兩相比較，組間菌群結構存在顯著差異；LEfse 分析結果顯示，各組大鼠的腸道菌群特定菌屬具有顯著差異。進一步比較各組乳桿菌科相對豐度發現，模型組乳桿菌科相對豐度較對照組降低，而經過補氣通竅方治療后乳桿菌科相對豐度較模型組上升，且補氣通竅方組略高于鼻炎康組，但兩者比較沒有統計學差異。

綜上所述，補氣通竅方可改善大鼠AR 的鼻炎癥狀，修復鼻黏膜組織病理損傷，其機制可能與提高乳桿菌相對豐度調節腸道微生態，下調脾臟組織NF-κB p65 蛋白表達有關。本研究同時觀察到，各組NF-κB p65 蛋白表達與乳桿菌科的相對豐度總體呈現負相關趨勢，但其關聯程度及影響機制仍需后續進一步研究。