動力蛋白相關蛋白1 抑制劑對腸黏膜上皮細胞缺血再灌注損傷的干預作用及其機制

圖拉妮薩·喀迪爾，張貽幗，景祎馨，廖師師，羅杰，丁可，陳榕，孟慶濤

武漢大學人民醫院麻醉科，武漢 430060

缺血再灌注損傷是由于組織長時間缺血后血流灌注恢復所致，當缺血組織恢復血流時，會加重缺血的有害影響，增強組織缺氧，激活先天免疫，增強炎癥反應及細胞死亡［1］。腸缺血再灌注損傷是外科手術導致腸組織損害的重要原因，與腸扭轉、腸移植、重度燒傷、創傷及休克等許多病理生理過程有關［2］。腸缺血再灌注損傷可導致腸黏膜屏障缺失，使內毒素及有害物質釋放入血，嚴重時可引起多器官功能障礙綜合征［3］。目前腸缺血再灌注損傷的具體病理生理機制仍未明確，線粒體功能障礙被認為是導致腸缺血再灌注損傷的關鍵因素。線粒體是一個高度動態的細胞器，能夠不斷進行裂變和融合，以保持其形狀、分布及大小，從而應對細胞的生理需求及外部環境的變化［4］。越來越多的研究表明，有效抑制線粒體裂變可以保護各種組織免受缺血再灌注損傷等應激誘導的損傷［5］。動力蛋白相關蛋白1（Drp1）是線粒體裂變的主要介質，可以加速線粒體分裂，產生大量片段化的線粒體，在線粒體裂變的調節中起著至關重要的作用。然而，Drp1 是否能通過介導線粒體裂變在腸缺血再灌注損傷中發揮作用尚不可知。2022 年5 月—2023 年8 月，本研究通過對人大腸黏膜上皮細胞Caco-2進行缺氧復氧（H/R）處理建立體外腸缺血再灌注損傷模型，觀察在體外模型中抑制Drp1 對腸缺血再灌注損傷的影響，探討線粒體動力學在腸缺血再灌注損傷中的作用機制，以期為腸缺血再灌注損傷的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人大腸黏膜上皮細胞系Caco-2 購自武漢普諾賽生命科技有限公司，線粒體膜電位檢測試劑盒、CCK-8 試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，線粒體超氧化物試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，Annexin V-EGFP/PI 凋亡試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，Drp1抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司，線粒體融合蛋白2（Mfn2）抗體購自美國CST公司。

1.2 細胞分組及H/R 模型建立 Caco-2 細胞使用含20%胎牛血清的MEM 培養基，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養，當細胞融合至80%時消化傳代。將Caco-2 細胞分為對照組、模型組、Drp1 抑制劑組，每組6個復孔。對照組正常培養細胞，模型組、Drp1抑制劑組均采用缺氧12 h 后復氧2 h 的方法構建H/R模型，Drp1 抑制劑組在H/R 前給予Drp1 抑制劑Mdivi-1干預1 h。

1.3 細胞活力觀察 采用CCK-8 法。各組進行不同處理之后繼續培養24 h，每孔加入含10% CCK-8的培養基100 μL，將培養板置于培養箱中孵育2 h，使用酶標儀測定450 nm處各孔光密度（OD）值。

1.4 細胞線粒體功能觀察 ①線粒體活性氧（ROS）含量：采用線粒體超氧化物指示劑法。各組進行不同處理之后繼續培養24 h，使用線粒體超氧化物指示劑檢測細胞內線粒體ROS 含量，按照線粒體超氧化物試劑盒說明書配置工作液，每孔加入2 mL 工作液覆蓋細胞，于37 ℃避光孵育10 min，用預熱的緩沖液洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察，采集相應的圖像，Image J 軟件分析ROS 平均熒光強度。②線粒體膜電位：采用JC-1 法。取分組處理后的各組細胞，用PBS 緩沖液洗滌2 次，配置JC-1 染色工作液和緩沖液，加入1 mL JC-1 染色緩沖液洗滌2 次。熒光顯微鏡下觀察并拍照，采用Image J 軟件分析各組平均熒光強度，表示線粒體膜電位大小。

1.5 細胞凋亡率測算 采用流式細胞術。取各組分組處理后培養24 h 的細胞，用不含EDTA 的胰酶消化，離心收集細胞，PBS 緩沖液洗滌2 次，加入100 μL結合液重懸，分別加入 2.5 μL FITC Annexin V及2.5 μL PI 染色液輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，加入400 μL 結合液重懸，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率，嚴格參照細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。

1.6 細胞Drp1、Mfn2 蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組分組處理后培養24 h的細胞，PBS緩沖液清洗，加入細胞裂解液，超聲、低溫12 000 r/min離心，收集蛋白上清液，使用BCA 法測定蛋白濃度。100 ℃變性10 min，使用SDS-PAG 凝膠快速試劑盒制膠，電泳，轉至PVDP膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入Drp1（1∶1 000）、Mfn2（1∶1 000），β-actin（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，室溫孵育相應二抗，TBST 洗滌，加入ECL 化學發光液，上機顯影。采用Image J 軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.7 統計學方法 采用GraphPad Prism 統計軟件。計量資料采用K-S正態性檢驗，呈正態分布時以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，重復測量數據采用重復測量的方差分析；非正態分布時以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞活力比較 對照組、模型組、Drp1 抑制劑組細胞活力分別為98.47 ± 1.60、41.90 ±3.30、78.80 ± 2.75，細胞活力對照組＞Drp1 抑制劑組＞模型組（P均＜0.05）。

2.2 各組細胞內線粒體ROS 含量及線粒體膜電位比較 細胞內線粒體ROS 含量模型組＞Drp1 抑制劑組＞對照組，線粒體膜電位對照組＞Drp1 抑制劑組＞模型組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組細胞內線粒體ROS含量及線粒體膜電位比較（）

表1 各組細胞內線粒體ROS含量及線粒體膜電位比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

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2.3 各組細胞凋亡率比較 對照組、模型組、Drp1抑制劑組細胞凋亡率分別為7.38% ± 0.68%、19.63% ± 1.31%、14.22% ± 0.89%，細胞凋亡率模型組＞Drp1抑制劑組＞對照組（P均＜0.05）。

2.4 各組細胞Drp1、Mfn2 蛋白表達比較 細胞Drp1蛋白表達模型組＞Drp1抑制劑組＞對照組，Mfn2蛋白表達對照組＞Drp1 抑制劑組＞模型組（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組細胞Drp1、Mfn2蛋白表達比較（）

表2 各組細胞Drp1、Mfn2蛋白表達比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

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3 討論

腸缺血再灌注損傷是臨床常見的組織器官損傷之一，往往導致腸道損傷及多個器官功能障礙，甚至危及生命［6-7］。腸缺血階段發生線粒體功能障礙、氧化應激及代謝紊亂，可誘發腸細胞損傷，血供恢復后大量炎癥因子和氧自由基釋放，誘導炎癥反應，引起廣泛的腸上皮細胞死亡，導致腸黏膜屏障功能受損，細菌、炎癥因子及內毒素釋放進入循環，引起全身炎癥反應綜合征，進而導致多器官功能障礙［8］。腸缺血再灌注損傷機制復雜，因而目前相關機制研究尚不完善。本研究使用人大腸黏膜上皮細胞Caco-2進行H/R，體外模擬腸缺血再灌注損傷，探討維持線粒體功能在腸缺血再灌注損傷中的作用，為腸缺血再灌注損傷的治療提供理論依據。

線粒體質量控制對于維持細胞穩態至關重要。過度的細胞外應激會導致線粒體穩態失衡，從而引起能量代謝紊亂，最終導致細胞死亡［9］。線粒體動力學是線粒體裂變與融合的動態平衡，保持裂變與融合的穩態是維持線粒體質量最重要的環節［10］。據文獻報道，線粒體動力學在多種疾病的發生發展中起到至關重要的作用［4，11］。Drp1 主要介導線粒體分裂，而Mfn2主要介導線粒體融合，Drp1、Mfn2參與調控線粒體內膜及外膜的融合與分裂過程［12］。本研究中使用Drp1 抑制劑Mdivi-1 對Caco-2 細胞進行預處理，觀察了H/R 刺激下線粒體功能及線粒體分裂與融合的變化。

線粒體是細胞能量轉換和新陳代謝的重要細胞器，也是氧化磷酸化合成ATP 的主要場所。線粒體膜電位是三羧酸循環相關氧化還原過程中產生的電化學勢能，正常的線粒體膜電位是維持線粒體進行氧化磷酸化產生ATP 的先決條件。線粒體膜電位不僅反映了線粒體功能的完整性，同時也反映了細胞的健康狀況，對細胞的生存和發展至關重要。因此，線粒體膜電位是評價線粒體功能的重要指標之一。線粒體是細胞產生ROS 的主要場所，ROS 是細胞氧化呼吸的正常代謝產物，可作為細胞內信號分子參與調節機體正常生理功能。當組織受損時，線粒體內ROS 產生大量增加，過多的ROS 會損害線粒體，導致線粒體功能異常。因此，ROS含量可在一定程度上反映線粒體功能。本研究結果顯示，使用H/R刺激Caco-2 細胞可引起細胞活性降低，出現線粒體膜電位下降，ROS生成增多的線粒體功能障礙表現。而經Drp1抑制劑干預的H/R模型細胞，細胞活性升高，線粒體膜電位升高，細胞ROS 生成減少，線粒體功能明顯改善。以上結果提示，抑制線粒體分裂可能通過減輕線粒體功能障礙來抑制H/R 引起的腸細胞損傷。

Drp1 不僅是線粒體分裂的重要參與者，還參與了程序性細胞死亡途徑。缺血誘導激活的Drp1 可導致線粒體過度分裂，線粒體膜通透性增加，并通過誘導線粒體BAX 易位增加細胞色素C 從線粒體向細胞質的釋放，并激活Caspase-3 及Caspase-9 信號通路，進而增強細胞凋亡［13-14］。本研究發現，Caco-2細胞在H/R 刺激下細胞凋亡率增加，選擇性抑制Drp1 后Caco-2 細胞凋亡率少于模型組，這可能與直接抑制Drp1減弱了程序性細胞凋亡有關。

有研究顯示，Drp1或Mfn2基因的調控在小鼠線粒體衰老及線粒體功能障礙中起著至關重要的作用，敲除小鼠Drp1 可加速線粒體衰老及功能障礙［15］。另有研究表明，Drp1 參與急性腎損傷、膿毒癥心肌細胞損傷、缺血再灌注損傷，阿爾茲海默癥等多種疾病的發生發展，在以上疾病模型中敲除Drp1或者使用Drp1 抑制劑之后均能起到保護線粒體功能、減輕損傷的治療作用［16］。本研究發現，Caco-2細胞在H/R刺激下Drp1蛋白表達上調，呈過度分裂狀態；而Mfn2蛋白表達下調，線粒體融合受到抑制，細胞處于線粒體動力學失衡狀態，提示H/R 損傷的發病機制可能與細胞的線粒體動力學穩態失衡有關。而Drp1 抑制劑預干預H/R 模型細胞后，Drp1 蛋白表達降低，Mfn2 蛋白表達升高，提示H/R 刺激引起的線粒體過度分裂現象得到緩解，線粒體融合增加，線粒體分裂與融合趨于平衡。這提示在腸缺血再灌注損傷中抑制Drp1 有助于維持線粒體動力學穩定，減輕細胞線粒體功能障礙，從而減輕細胞損傷。

綜上所述，Drp1 抑制劑可減輕腸黏膜上皮細胞缺血再灌注損傷，其機制可能與改善線粒體功能障礙，減少細胞凋亡有關。然而，Drp1 調控線粒體功能的具體機制仍有待進一步的研究，后續仍需要進行動物實驗來驗證以上結論。