雙硫侖聯合紫杉醇對食管癌細胞增殖、侵襲能力的抑制作用及其機制

馮曉延，熊榮生，許可，徐誼，王浩

廣西壯族自治區南溪山醫院胸外科，廣西桂林 541002

食管癌是消化系統中最具侵襲性的惡性腫瘤之一，其發病率、病死率呈逐漸增長趨勢［1］。大部分食管癌患者就診時已處于局部晚期或有遠處轉移，需要新輔助治療降級后手術或進行姑息性放化療。紫杉醇是一種天然抗癌藥物，目前在臨床上廣泛應用于乳腺癌［2］、卵巢癌［3］及肺癌［4］的治療中。在食管癌的新輔助治療及晚期食管癌治療中，紫杉醇均有不錯的臨床表現，但仍有部分患者化療效果不佳［5-6］。雙硫侖最初作為戒酒藥物使用，近期有研究發現其具有潛在的抗腫瘤藥理作用［7］。微管是由α/β/γ 微管蛋白組成的異二聚體，是細胞骨架的重要組成部分，在細胞的多種生理過程中發揮重要作用，干擾微管蛋白聚合和解聚可以干擾腫瘤細胞的有絲分裂，進而抑制腫瘤生長。B 細胞淋巴瘤2（Bcl-2）在多種惡性腫瘤中均呈不同程度高表達，其具有抑制細胞凋亡的作用，抑制Bcl-2表達是非常有潛力的抗腫瘤治療方法。2023年4月—7月，本研究觀察了雙硫侖聯合紫杉醇對人食管癌細胞增殖、侵襲能力的影響及其可能的機制，以期為雙硫侖應用于食管癌的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 食管癌細胞TE-1、TE-10 均購自中國科學院分子細胞科學卓越創新中心，雙硫侖、紫杉醇購自大連美侖生物技術有限公司。α 微管蛋白抗體、Bcl-2 抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，實時熒光定量PCR 儀購自美國Bio-Rad 公司，流式細胞儀購自美國Thermo Fisher Scientific。

1.2 雙硫侖最佳作用濃度篩選 食管癌細胞株TE-1、TE-10 放置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中傳代培養，細胞融合度達85%時，胰蛋白酶消化傳代。分別取對數生長期的TE-1、TE-10 細胞，以5 × 103/孔接種于96 孔板，每組設置6 個復孔，置于37 ℃，5% CO2恒溫培養箱中培養，至細胞融合至85%～90%后，棄去上清，分別加入不同濃度的雙硫侖（0、10、20、40 μmol/L），繼續孵育24 h后，每孔去掉培養液，使用PBS 液沖洗2 遍后，吸棄孔內PBS 液，每孔加入100 μL 含10% CCK-8 的細胞培養液，孵育1～4 h（根據具體顯色情況而定），孵育結束后，用酶標儀測定450 nm 處的吸光度值。CCK-8 結果顯示，0、10、20、40 μmol/L雙硫侖處理的TE-1細胞活力分別為100% ± 1.22%、88.31% ±1.33%、78.80% ± 1.76%、79.82% ± 2.19%，TE-10 細胞活力分別為100% ±0.95%、88.52% ± 1.33%、80.01% ± 2.20%、80.27% ±1.40%。與0 μmol/L 雙硫侖處理比較，10、20、40 μmol/L 雙硫侖處理均可降低TE-1、TE-10細胞的活力（P均＜0.01），抑制效果最佳的濃度是20 μmol/L。因此，后續選擇20 μmol/L 為雙硫侖的干預濃度。

1.3 細胞培養及分組處理 將TE-1、TE-10 食管癌細胞分別分為對照組、雙硫侖組、紫杉醇組、雙硫侖+紫杉醇組。對照組在細胞鋪板培養24 h 后更換新鮮培養液再繼續培養24 h；雙硫侖組在細胞鋪板培養24 h 后將培養液更換為20 μmol/L 的雙硫侖培養液后，再繼續培養24 h；紫杉醇組在細胞鋪板培養24 h 后將培養液更換為0.5 μmol/L 的紫杉醇培養液后，再繼續培養24 h；雙硫侖+紫杉醇組在細胞鋪板培養24 h 后將培養液更換為20 μmol/L 雙硫侖及0.5 μmol/L紫杉醇的混合培養液后，再繼續培養24 h。

1.4 細胞增殖能力觀察 采用MTT 法。各組細胞分組處理后培養箱繼續孵育24 h，向孔內加入25 μL MTT 溶液，繼續培養4 h。小心吸棄孔內培養液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩15 min，酶標儀測定570 nm 處的吸光度（A）值，計算細胞增殖率。細胞增殖率=（A實驗孔-A對照孔）/A對照孔×100%。

1.5 細胞凋亡情況觀察 采用流式細胞術。各組細胞分組處理后培養箱繼續孵育24 h，加入1 mL 胰酶消化，1 500 r/min 離心10 min，去掉上清。用2 mL PBS 重懸清洗一遍后再次離心，用提前預冷好的70%乙醇將收集的細胞重懸固定，并放入-20 ℃冰箱。次日離心去除多余的乙醇溶液，并用PBS 洗滌3次后加入500 μL的PI染料避光染色30 min。使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，每組實驗重復3次，取平均值。

1.6 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell 實驗。各組以1 × 106/mL 細胞懸液加入Transwell 的上室中，下室中加入含20%胎牛血清的培養基溶液。置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中24 h，用結晶紫染色上室底部的細胞；棉簽擦拭上室細胞，倒置顯微鏡下計數穿膜細胞數并取平均值。

1.7 細胞α 微管蛋白mRNA 檢測 采用RT-qPCR法。各組細胞分組處理后培養箱繼續孵育24 h，用TRIzol 法提取總RNA。將RNA 進行逆轉錄，并對互補DNA 進行RT-qPCR 檢測。引物序列：α 微管蛋白上游引物5′-AAGTGCGGGATCAACTACCA-3′，下游引物5′-GCACGCTTCGAGTACATCAG-3′；GAPDH上游引物5′-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′，下游引物5′-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′。反應條件：75 ℃預變性2 min， 90 ℃變性5 min，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s；共40 次循環。以GAPDH為內參，以2-ΔΔCt表示α 微管蛋白mRNA 相對表達量。

1.8 細胞α微管蛋白、Bcl-2蛋白檢測 采用Western blotting 法。各組細胞分組處理后培養箱繼續孵育24 h 后收集各組細胞，PBS 清洗3 次后，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行裂解提取總蛋白，等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉至PVDF膜。用5% BSA 進行封閉，依次孵育相應的一抗及二抗。使用ECL Plus 化學發光系統進行顯影［8］，Image J 軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量，每組實驗重復3次。

1.9 統計學方法 采用Graphpad Prism9 統計軟件。計量資料采用K-S 正態性檢驗，呈正態分布時以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，重復測量數據采用重復測量的方差分析；非正態分布時以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖能力比較 TE-1 細胞對照組、雙硫侖組、紫杉醇組、雙硫侖+紫杉醇組細胞增殖率分別為100% ± 4.00%、84.61% ± 1.30%、68.19% ±2.94%、49.13% ± 1.41%，TE-10 細胞對照組、雙硫侖組、紫杉醇組、雙硫侖+紫杉醇組細胞存活率分別為100% ± 1.70%、79.48% ± 4.38%、62.27% ±1.34%、45.35% ± 3.65%；TE-1及TE-10細胞存活率對照組＞雙硫侖組＞紫杉醇組＞雙硫侖+紫杉醇組（P均＜0.05）。

2.2 各組細胞凋亡率比較 TE-1 細胞對照組、雙硫侖組、紫杉醇組、雙硫侖+紫杉醇組細胞凋亡率分別為2.46% ± 0.07%、10.92% ± 0.30%、16.95% ±0.71%、29.61% ± 0.44%，TE-10 細胞對照組、雙硫侖組、紫杉醇組、雙硫侖+紫杉醇組細胞凋亡率分別為5.49% ± 0.19%、9.30% ± 0.66%、12.04% ±0.42%、16.79% ± 0.59%；TE-1及TE-10細胞凋亡率對照組＜雙硫侖組＜紫杉醇組＜雙硫侖+紫杉醇組（P均＜0.05）。

2.3 各組細胞侵襲能力比較 TE-1 細胞對照組、雙硫侖組、紫杉醇組、雙硫侖+紫杉醇組穿膜細胞數分別為（127.11 ± 1.58）、（69.00 ± 2.33）、（28.59 ±3.17）、（15.00 ± 1.86）個，TE-10 細胞對照組、雙硫侖組、紫杉醇組、雙硫侖+紫杉醇組穿膜細胞數分別為（146.78 ± 9.79）、（63.44 ± 6.00）、（31.89 ±4.22）、（15.33 ± 1.20）個；TE-1及TE-10細胞穿膜細胞數對照組＞雙硫侖組＞紫杉醇組＞雙硫侖+紫杉醇組（P均＜0.05）。見圖1。

圖1 各組細胞侵襲能力比較（Transwell實驗）

2.4 各組細胞α 微管蛋白mRNA 比較 TE-1 細胞對照組、雙硫侖組、紫杉醇組、雙硫侖+紫杉醇組α微管蛋白mRNA 表達分別為1.00 ± 0.08、0.60 ±0.06、0.41 ± 0.01、0.21 ± 0.01，TE-10 細胞對照組、雙硫侖組、紫杉醇組、雙硫侖+紫杉醇組α 微管蛋白mRNA 表達分別為1.00 ± 0.08、0.63 ± 0.04、0.29 ±0.02、0.18 ± 0.01；TE-1 細胞α 微管蛋白mRNA 表達對照組＞雙硫侖組＞紫杉醇組＞雙硫侖+紫杉醇組，TE-10 細胞α 微管蛋白mRNA 表達對照組＞雙硫侖組＞紫杉醇組、雙硫侖+紫杉醇組（P均＜0.05）。

2.5 各組細胞α 微管蛋白、Bcl-2 蛋白比較 TE-1及TE-10細胞α微管蛋白、Bcl-2蛋白表達對照組＞雙硫侖組＞紫杉醇組＞雙硫侖+紫杉醇組（P均＜0.05）。見表1～2。

表1 各組TE-1細胞α微管蛋白、Bcl-2蛋白比較（）

表1 各組TE-1細胞α微管蛋白、Bcl-2蛋白比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與雙硫侖組比較，#P＜0.05；與紫杉醇組比較，△P＜0.05。

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表2 各組TE-10細胞α微管蛋白、Bcl-2蛋白比較（）

表2 各組TE-10細胞α微管蛋白、Bcl-2蛋白比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與雙硫侖組比較，#P＜0.05；與紫杉醇組比較，△P＜0.05。

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3 討論

食管癌是最具侵襲性的消化道惡性腫瘤之一，發病率及病死率較高。目前，根治性手術是治療早期食管癌的最佳策略，而晚期食管癌患者通常需要術前和圍手術期放化療的組合治療。由于食管癌的高增殖及侵襲能力，多數患者在首次診斷時已經發生腫瘤轉移或進展到晚期，因此預后較差。紫杉醇是治療食管癌常見的化療藥物，而對紫杉醇化療的獲得性耐受是食管癌患者化療效果不佳的重要原因。雙硫侖作為常見的戒酒藥物，已經在多種腫瘤細胞實驗中被證明有抗腫瘤作用。研究發現，雙硫侖可通過產生活性氧、抑制腫瘤細胞上皮—間質轉化、細胞自噬及調節細胞免疫等機制抑制腫瘤細胞的增殖及轉移［7］。而在食管癌方面，亦有研究發現雙硫侖不僅有抗腫瘤效果［9］，還可能增強食管癌干細胞的放射敏感性［10］。

本研究以TE-1 和TE-10 食管癌細胞為實驗對象，觀察雙硫侖聯合紫杉醇對食管癌細胞株增殖、侵襲能力的影響，結果顯示，與紫杉醇單藥比較，雙硫侖聯合紫杉醇可更顯著地抑制食管癌細胞的增殖及侵襲。且本研究發現，雙硫侖單藥亦有抑制食管癌細胞增殖的作用，因此推測雙硫侖對食管癌細胞紫杉醇化療有協同作用。在此基礎上，進一步研究發現雙硫侖與紫杉醇聯合對食管癌細胞的凋亡亦有影響。本研究結果顯示，雙硫侖與紫杉醇聯合處理后，TE-1、TE-10 細胞的凋亡率增加，提示兩藥聯合可能通過促進凋亡的方式發揮對食管癌的抑制作用。

微管主要由α 微管蛋白、γ 微管蛋白、β 微管蛋白三種蛋白構成，是細胞質骨架的重要組成部分，其在細胞有絲分裂、細胞運動等方面具有重要作用。鑒于微管的重要作用，微管蛋白也逐漸成為抗腫瘤研究中的一個熱門靶點。β 微管蛋白是目前關于腫瘤生物學行為研究較多的微管蛋白，其與腫瘤的發生及不良預后有關［11-12］。比較之下，α 微管蛋白的研究相對較少。近年研究發現，α 微管蛋白高表達與腫瘤發生有關［13］，同時α 微管蛋白的去酪氨酸化和乙酰化與腫瘤細胞侵襲及轉移相關［14-15］。而紫杉醇的抗腫瘤機制主要是通過促進微管穩定，抑制微管解聚功能，抑制α 微管蛋白表達有絲分裂正常進行，從而觸發腫瘤細胞凋亡實現的。本研究發現，雙硫侖及紫杉醇單藥均可使食管癌細胞中的α 微管蛋白表達減少，而雙藥聯合組中抑制作用更為明顯。因此推測α 微管蛋白的減少影響了細胞內微管的構成，使其不能發揮正常功能，進而促使腫瘤細胞死亡。但其中是否有微管蛋白乙酰化尚不明確，需要進一步研究。

Bcl-2是一種癌癥基因，在腫瘤研究中扮演著重要的角色。該基因編碼的蛋白質也稱為Bcl-2，其是一種調控細胞凋亡的關鍵蛋白質，與之相拮抗的是Bax 蛋白。Bcl-2 及Bax 是兩種重要的調控細胞凋亡的蛋白質，Bcl-2 為抗凋亡蛋白，而Bax 為促凋亡蛋白，兩者在調節細胞生命和死亡過程中相互作用［16-17］。有研究發現，Bcl-2 過表達可增加腫瘤細胞的增殖［18］，而沉默Bcl-2 則可抑制腫瘤細胞的增殖［19-20］。細胞凋亡也是雙硫侖抗腫瘤作用的機制之一，GAN 等［21］研究發現，雙硫侖可通過下調Bcl-2 表達及上調Bax 表達促進子宮內膜樣上皮性卵巢癌細胞死亡。本研究發現，雙硫侖單藥及紫杉醇單藥組中Bcl-2 的表達均有下降，而雙藥聯合組Bcl-2 的表達下降最為明顯。張曉晶等［22］研究表明，紫杉醇誘導A375 黑色素瘤細胞凋亡的機制可能與Bc-l2/Bax的比值下調有關；而陳曦等［23］研究表明，沉默Bcl-2不僅可以促進胃癌細胞凋亡，同時可增強胃癌細胞對紫杉醇的敏感性。

綜上所述，雙硫侖聯合紫杉醇可增強對食管癌細胞增殖、侵襲能力的抑制作用，其機制可能與降低細胞中微管蛋白表達，促進細胞凋亡有關，但其具體的作用機制仍需下一步深入研究。