miR-203a-3p對食管癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響及其與Survivin的靶向調(diào)控關(guān)系

鄭競雄，黃景濤，孫光蕊，趙寶山，梁宗英

承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科，河北承德 067000

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤，其病死率高且預(yù)后較差［1］。靶向治療的出現(xiàn)幫助部分食管癌患者改善了預(yù)后，但食管癌患者總體生存質(zhì)量依然不夠理想［2］。微小RNA（miRNA）屬于非編碼小RNA家族，可以通過與靶基因的非編碼區(qū)域結(jié)合來激活或抑制癌癥的進(jìn)展［3］。研究表明，miR-203a-3p 在食管癌中表達(dá)異常，并可能通過調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)參與食管癌的增殖、侵襲及遷移［4-5］。Survivin 是凋亡抑制蛋白家族的新成員，具有腫瘤特異性，只表達(dá)于腫瘤及胚胎組織，且與腫瘤細(xì)胞的分化增殖及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［6-7］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Survivin在食管癌中高表達(dá)，且與腫瘤分期、分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)［8］。而miR-203a-3p 與Survivin 之間是否有關(guān)尚未見報(bào)道。2022 年10 月—2023 年10 月，本研究觀察了miR-203a-3p 對食管癌TE-1 細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響，并對miR-203a-3p 及Survivin 的靶向調(diào)控關(guān)系進(jìn)行了分析，以期為食管癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 食管癌細(xì)胞系TE-1、正常食管黏膜上皮細(xì)胞系HEEC 均購自廣州天駿生物科技有限公司。miR-203a-3p mimic、miR-203a-3p inhibitor 及miR-203a-3p NC 購自上海雅吉生物科技有限公司；LipofectamineTM3000 Transfection Reagent 購自石家莊旺迪生物科技有限公司；miR-203a-3p、Survivin、U6、GAPDH 引物序列由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 細(xì)胞miR-203a-3p、Survivin mRNA 檢測 采用RT-qPCR 法。收集對數(shù)生長期的食管癌細(xì)胞TE-1及正常食管黏膜上皮細(xì)胞HEEC。采用TRIzol 法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列：miR-203a-3p上游引物5′-GGCATGGGTGCCCCGACGTT-3′，下游引物5-AGAGGCCTCAATCCATGGCA-3′；Survivin上游引物5′-GCCGGTACCATGGGTGCCCCGACG-3′，下游引物5′-GCCCTCGAGTCAATCCAGGGCAGC-3′；U6 上游引物5′-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；GAPDH 上游引物5′-CGACCACTTTGACAAGCTCA-3′，下游引物5′-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3′。以U6 為miR-203a-3p 內(nèi)參，GAPDH 為Survivin 內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-203a-3p、Survivin mRNA相對表達(dá)量。

1.3 miR-203a-3p 與Survivin 的靶向調(diào)控關(guān)系分析 采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測法。通過TargetScan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-203a-3p 的潛在靶基因；將TE-1 細(xì)胞分為四部分，分別共轉(zhuǎn)染Survivin-WT、Survivin-MUT 和miR-203a-3p mimic、陰性對照NC 質(zhì)粒，光度計(jì)檢測熒光素酶活性。

1.4 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 TE-1 細(xì)胞于F12K 培養(yǎng)基中常規(guī)接種，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。將TE-1 細(xì)胞分為對照組、miR-203a-3p模擬組、miR-203a-3p抑制組及陰性對照組。取對數(shù)生長期的TE-1 細(xì)胞，以3 × 105/孔接種至6 孔板中，使用LipofectamineTM3000 試劑盒對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，miR-203a-3p 模擬組轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimic，miR-203a-3p抑制組轉(zhuǎn)染miR-203a-3p inhibitor，陰性對照組轉(zhuǎn)染miR-203a-3p NC，對照組不轉(zhuǎn)染。參照“1.2”的方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，RT-qPCR 檢測顯示轉(zhuǎn)染效率合格。

1.5 細(xì)胞活力檢測 采用MTT 法。分別于轉(zhuǎn)染后2、12、24、36、48 h將各組細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，每孔加入30 μL MTT 溶液，常溫下孵育4 h 后棄上清，加入二甲基亞砜、每孔150 μL，80 r/min 搖勻，待結(jié)晶消失后，使用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在570 nm 處的吸光度（A）值，以此表示細(xì)胞活力。

1.6 細(xì)胞遷移能力檢測 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。各組轉(zhuǎn)染后24 h收集細(xì)胞接種于24孔板中，行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿孔底后，用槍頭在板底部作“一”字劃痕，PBS 清洗2 次后更換培養(yǎng)液，分別于0、48 h鏡下拍照記錄，測量劃痕距離，其差值即為細(xì)胞遷移距離。

1.7 細(xì)胞侵襲能力檢測 采用Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)。取Transwell 小室，使用制好的Matrigel 基質(zhì)膠將上室包裹24 h。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞懸液以2 × 104/孔接種于上室，下室添加培養(yǎng)基500 μL，正常培養(yǎng)48 h 后棄培養(yǎng)基。無菌棉簽擦拭上室未穿膜細(xì)胞，下層細(xì)胞多聚甲醛溶液固定后行結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下隨機(jī)觀察并計(jì)數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS27.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk 進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以-x±s表示，兩組數(shù)據(jù)比較行t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較行單因素方差分析，重復(fù)測量數(shù)據(jù)行重復(fù)測量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌細(xì)胞及正常食管黏膜上皮細(xì)胞miR-203a-3p、Survivin mRNA 表達(dá)比較 食管癌細(xì)胞及正常食管黏膜上皮細(xì)胞中miR-203a-3p mRNA 表達(dá)分別為0.36 ± 0.07、1.45 ± 0.11，Survivin mRNA 表達(dá)分別為1.25 ± 0.08、0.35 ± 0.07；食管癌細(xì)胞中miR-203a-3p mRNA 表達(dá)低于正常食管黏膜上皮細(xì)胞，Survivin mRNA 表達(dá)高于正常食管黏膜上皮細(xì)胞（P均＜0.05）。

2.2 miR-203a-3p 與Survivin 的靶向調(diào)控關(guān)系分析結(jié)果 通過TargetScan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-203a-3p 的潛在靶基因，發(fā)現(xiàn)在Survivin 基因的3′UTR 端存在7 個連續(xù)的可以與miR-203a-3p 互補(bǔ)的核苷酸序列，且結(jié)合穩(wěn)定性高，提示Survivin 可能為miR-203a-3p的潛在靶基因。見圖1。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染Survivin-WT和miR-203a-3p mimic質(zhì)粒的TE-1 細(xì)胞相對熒光素酶活性低于其他細(xì)胞（P＜0.05），提示Survivin 是miR-203a-3p 的靶基因。見圖2。

圖1 Survivin 3'UTR與miR-203a-3p的結(jié)合位點(diǎn)

圖2 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果

2.3 各組細(xì)胞活力比較 培養(yǎng)12、24、36、48 h時細(xì)胞活力miR-203a-3p 抑制組＞對照組、陰性對照組＞miR-203a-3p模擬組（P均＜0.05）。見表1。

表1 培養(yǎng)不同時點(diǎn)各組細(xì)胞活力比較（）

表1 培養(yǎng)不同時點(diǎn)各組細(xì)胞活力比較（）

注：與對照組同時點(diǎn)比較，*P＜0.05。

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2.4 各組細(xì)胞遷移能力比較 對照組、陰性對照組、miR-203a-3p 模擬組、miR-203a-3p 抑制組細(xì)胞遷移距離分別為（338 ± 20）、（335 ± 22）、（112 ± 21）、（527 ± 23）μm；細(xì)胞遷移距離miR-203a-3p 抑制組＞對照組、陰性對照組＞miR-203a-3p 模擬組（P均＜0.05）。

2.5 各組細(xì)胞侵襲能力比較 對照組、陰性對照組、miR-203a-3p 模擬組、miR-203a-3p 抑制組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（96 ± 13）、（98 ± 12）、（46 ± 7）、（185 ±14）個；侵襲細(xì)胞數(shù)miR-203a-3p 抑制組＞對照組、陰性對照組＞miR-203a-3p模擬組（P均＜0.05）。

3 討論

食管癌是一種惡性腫瘤，其患病率和病死率均相對較高。雖然近年來患者術(shù)后生存率略有提高，但總體預(yù)后仍有待進(jìn)一步改善［9］。Survivin 是一種抗凋亡基因，與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡聯(lián)系緊密［10-11］。根據(jù)本課題組前期對食管癌的研究發(fā)現(xiàn)，Survivin高表達(dá)與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)［12］。miRNA 可通過阻斷靶信使RNA 的翻譯或降解靶基因來調(diào)控多種靶基因的轉(zhuǎn)錄后效應(yīng)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［13］。有研究發(fā)現(xiàn)，Survivin 在食管癌中與miR-143、miR-145 的表達(dá)具有相關(guān)性［14］，然而至今仍未明確Survivin 上游miRNA 的具體調(diào)控機(jī)制及其作用［15］。

miRNA 在癌癥的診斷、治療及預(yù)后評估方面具有至關(guān)重要的作用，有數(shù)據(jù)顯示，差異表達(dá)的miRNA可能是食管癌形成和發(fā)展的主要因素之一，并可以作為食管癌的診斷及預(yù)后標(biāo)志物［16-17］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-203a-3p在腎癌細(xì)胞中低表達(dá)，可能通過抑制糖原合成酶激酶-3β 表達(dá)提升腫瘤細(xì)胞的增殖能力，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡［18］。此外，CHEN 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，miR-203a-3p 在肺癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，且通過與LINC00342 相互作用促進(jìn)肺癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果顯示，miR-203a-3p 在食管癌TE-1細(xì)胞中表達(dá)降低，提示miR-203a-3p 可能參與了食管癌的發(fā)生發(fā)展。然而，目前尚未有研究報(bào)道m(xù)iR-203a-3p能否作為上游分子調(diào)控Survivin參與食管癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究前期通過Targetscan 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，Survivin 存在與miR-203a-3p 互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，miR-203a-3p可能是調(diào)控Survivin基因的上游分子。進(jìn)一步進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，共轉(zhuǎn)染野生型Survivin 3′UTR載體能夠顯著降低食管癌TE-1細(xì)胞的熒光素酶活性，而共轉(zhuǎn)染突變型Survivin 3′UTR載體細(xì)胞的熒光素酶活性無明顯變化，提示Survivin是miR-203a-3p 的靶基因。通過人工合成miRNA 產(chǎn)物外源性改變miR-203a-3p 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimic 過表達(dá)miR-203a-3p 可減弱TE-1 的細(xì)胞活力，并抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力；而敲低miR-203a-3p 表達(dá)會使細(xì)胞活力、遷移和侵襲能力增強(qiáng)。

綜上所述，miR-203a-3p高表達(dá)可抑制食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能與靶向負(fù)調(diào)控Survivin 有關(guān)。上述研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，同時為食管癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。