黃芩苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和焦亡的抑制作用及其機(jī)制

靳宜靜，李堪董，詹智暉，王勇

1 海南西部中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，海南儋州 571000；2 海南西部中心醫(yī)院神經(jīng)外科

心血管疾病對(duì)人類健康威脅極大，且患病率與病死率均較高［1］。焦亡是一種由焦孔素D（GSDMD）介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡方式，其在各種心血管疾病的發(fā)病中起著關(guān)鍵作用，可發(fā)生于心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷、心力衰竭等疾病中［2］。細(xì)胞焦亡與炎癥密切相關(guān)。核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體激活、半胱氨酸蛋白酶1（Caspase-1）的活性轉(zhuǎn)化以及白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6 等炎癥因子的高表達(dá)是細(xì)胞焦亡發(fā)生的關(guān)鍵特征［3］。與此同時(shí)，細(xì)胞發(fā)生焦亡會(huì)導(dǎo)致質(zhì)膜孔的形成，使細(xì)胞腫脹、溶解，細(xì)胞膜破裂，從而促進(jìn)炎癥因子釋放，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。因此，通過多種方式干預(yù)并抑制細(xì)胞焦亡過程在許多情況下具有心臟保護(hù)作用。炎癥反應(yīng)是各類心血管疾病的基本病理特征，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的心肌損傷中，炎癥發(fā)揮著關(guān)鍵作用［4］。另有研究發(fā)現(xiàn)，LPS會(huì)誘導(dǎo)磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/絲蘇氨酸蛋白激酶（AKT）信號(hào)通路的激活，從而高表達(dá)下游炎癥因子并促進(jìn)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞焦亡的發(fā)生［5］。黃芩苷是黃芩的主要有效成分，具有抗細(xì)胞凋亡和抗氧化等生物學(xué)功能，可提高心肌功能，對(duì)心血管疾病具有的潛在保護(hù)作用［6］。但是，黃芩苷是否可能通過對(duì)心肌細(xì)胞焦亡及炎癥反應(yīng)的調(diào)控發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，同時(shí)是否通過PI3K/AKT 信號(hào)通路影響心肌細(xì)胞的焦亡及炎癥反應(yīng)尚未可知。基于此，2021年2 月—2023 年11 月，本研究通過LPS 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，觀察黃芩苷對(duì)心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及焦亡的影響并分析其機(jī)制是否與PI3K/AKT 信號(hào)通路有關(guān)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料 大鼠心肌細(xì)胞株H9C2購自河南省工業(yè)微生物菌種工程技術(shù)研究中心。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco 公司，黃芩苷、LPS、PI3K/AKT通路抑制劑LY294002、PI3K/AKT通路激活劑胰島素樣生長因子1（IGF-1）購自上海源葉生物科技有限公司，CCK-8試劑盒購自南京諾唯贊有限公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司，PI3K、AKT、磷酸化PI3K（p-PI3K）、p-AKT、NLRP3、GSDMD、Caspase-1、β-actin一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠（兔）二抗均購自英國Abcam 公司。Multiskan FC 酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司，DMI1型光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)購自德國Leica 公司，HF151 型二氧化碳培養(yǎng)箱購自武漢益普生物科技有限公司，DYCZ-24KF 型四板垂直蛋白電泳儀購自北京六一生物科技有限公司，ZF-288 型凝膠成像系統(tǒng)購自上海金鵬分析儀器有限公司。

1.2 黃芩苷干預(yù)濃度篩選及細(xì)胞分組處理 心肌細(xì)胞株H9C2復(fù)蘇培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中，置于70%～80%濕度、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d換一次細(xì)胞培養(yǎng)液。取對(duì)數(shù)期H9C2細(xì)胞接種到96孔板，分為對(duì)照組（不做干預(yù)），LPS組（以10 μg/mL LPS刺激24 h構(gòu)建體外細(xì)胞損傷模型［7］），黃芩苷組（LPS構(gòu)建體外細(xì)胞損傷模型后分別加入10、20、40、80 μmol/L黃芩苷），干預(yù)24 h后加入10 μL CCK-8溶液培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=（LPS 組或?qū)嶒?yàn)組OD 值/對(duì)照組OD值）×100%。結(jié)果顯示，對(duì)照組、LPS 組及10、20、40、80 μmol/L 黃芩苷組細(xì)胞活力分別為100.00% ±9.22%、58.21% ± 5.89%、82.33% ± 8.42%、69.00% ± 7.32%、68.67% ± 7.03%、43.00% ±4.41%，LPS 組細(xì)胞活力低于對(duì)照組，10、20 μmol/L黃芩苷組細(xì)胞活力高于LPS組，選取細(xì)胞活力最佳的10 μmol/L 黃芩苷進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。而后取對(duì)數(shù)期H9C2細(xì)胞分為對(duì)照組、LPS組、黃芩苷組、抑制劑組、黃芩苷+抑制劑組及黃芩苷+激活劑組，除不做干預(yù)的對(duì)照組外均給予10 μg/mL LPS刺激24 h構(gòu)建細(xì)胞損傷模型；黃芩苷組在此基礎(chǔ)上給予10 μmol/L黃芩苷，抑制劑組給予5 μmol/L PI3K/AKT 通路抑制劑LY294002［8］，黃芩苷+抑制劑組給予10 μmol/L 黃芩苷及5 μmol/L LY294002，黃芩苷+激活劑組給予10 μmol/L黃芩苷及100 ng/mL PI3K/AKT通路激活劑IGF-1［9］。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3 細(xì)胞上清液炎癥因子檢測(cè) 采用ELISA 法。取干預(yù)24 h 后的各組細(xì)胞，收集細(xì)胞上清液，按照IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒說明書操作步驟，測(cè)定細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-1β及IL-6。

1.4 細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。取干預(yù)24 h的各組細(xì)胞，提取蛋白，定量并上樣，進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，利用脫脂牛奶法進(jìn)行膜封閉，加入稀釋后的GSDMD、NLRP3、Caspase-1及β-actin一抗4 ℃孵育過夜，加入抗鼠IgG二抗稀釋液，室溫孵育2 h，進(jìn)行3次洗滌后加入顯影液，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行圖片采集。蛋白灰度用Image J圖像分析軟件確定，內(nèi)參為β-actin，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示GSDMD、NLRP3、Caspase-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。取干預(yù)24 h的各組細(xì)胞，參照“1.4”的方法進(jìn)行蛋白提取及電泳，加入稀釋后的PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT及β-actin一抗孵育過夜，加入IgG二抗稀釋液，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行圖片采集。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8軟件。所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)，組間兩兩比較采用Dunnett'st檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞上清液IL-6、IL-1β 水平比較 與對(duì)照組比較，LPS 組細(xì)胞上清液炎癥因子IL-6、IL-1β水平升高；與LPS 組比較，黃芩苷組、抑制劑組IL-6、IL-1β 水平降低；與黃芩苷組比較，黃芩苷+抑制劑組IL-6、IL-1β 水平降低，黃芩苷+激活劑組IL-6、IL-1β水平升高（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組細(xì)胞上清液IL-6、IL-1β水平比較（pg/mL，）

表1 各組細(xì)胞上清液IL-6、IL-1β水平比較（pg/mL，）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與LPS 組比較，#P＜0.05；與黃芩苷組比較，△P＜0.05。

?

2.2 各組細(xì)胞GSDMD、NLRP3、Caspase-1 蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，LPS 組細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白GSDMD、NLRP3、Caspase-1 表達(dá)升高；與LPS 組比較，黃芩苷組、抑制劑組GSDMD、NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)水平降低；與黃芩苷組比較，黃芩苷+抑制劑組GSDMD、NLRP3、Caspase-1 蛋白表達(dá)降低，黃芩苷+激活劑組GSDMD、NLRP3、Caspase-1 蛋白表達(dá)升高（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組細(xì)胞GSDMD、NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)比較（）

表2 各組細(xì)胞GSDMD、NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與LPS 組比較，#P＜0.05；與黃芩苷組比較，△P＜0.05。

?

2.3 各組細(xì)胞PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT 蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，LPS組PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白p-PI3K、p-AKT 表達(dá)升高；與LPS 組比較，黃芩苷組、抑制劑組p-PI3K、p-AKT 蛋白表達(dá)水平降低；與黃芩苷組比較，黃芩苷+抑制劑組p-PI3K、p-AKT 蛋白表達(dá)降低，黃芩苷+激活劑組p-PI3K、p-AKT 蛋白表達(dá)升高（P均＜0.05）；各組PI3K、AKT 蛋白表達(dá)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表3。

表3 各組細(xì)胞PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)比較（）

表3 各組細(xì)胞PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05；與黃芩苷組比較，△P＜0.05。

?

3 討論

黃芩苷是一種從紫草科黃芩根部提取的黃酮類活性物質(zhì)，已被用于治療癌癥、骨關(guān)節(jié)炎、腎炎和肝炎等多種疾病［10］。研究表明，黃芩苷具有抗氧化、抗炎和抗細(xì)胞凋亡活性［11］。既往研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能夠通過減弱缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的損傷來保護(hù)大鼠心肌細(xì)胞［12］。XUE 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可通過抑制芳基烴受體表達(dá)減輕心肌缺血炎癥損傷。LIU 等［14］研究表明，黃芩苷可通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶通路來減輕大鼠心肌梗死造成的心肌損傷。本研究結(jié)果顯示，LPS 組H9C2 細(xì)胞活力低于對(duì)照組，而10、20 μmol/L 黃芩苷組H9C2 細(xì)胞活力高于LPS 組，提示黃芩苷可有效提高大鼠心肌細(xì)胞損傷模型的細(xì)胞活力，具有心肌細(xì)胞保護(hù)作用。

GSDMD 是GSDMs 家族的一員，近期被確定為炎癥小體的新組分，是焦亡的執(zhí)行因子。GSDMD 可介導(dǎo)膜孔形成、細(xì)胞腫脹和溶解，并且Caspase-1 對(duì)GSDMD 的切割誘導(dǎo)了細(xì)胞焦亡發(fā)生，是促炎介質(zhì)IL-1β 分泌所必需的，與心肌缺血再灌注損傷、心肌梗死、心力衰竭等多種心血管疾病密切相關(guān)［15］。炎癥小體在細(xì)胞焦亡中發(fā)揮重要作用，可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)多種生物過程，包括轉(zhuǎn)錄、抗原遞呈、自噬、胚胎發(fā)育等［16］。近年來發(fā)現(xiàn)，中藥單體成分也能通過影響NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡發(fā)揮抗心肌損傷作用。XU等［17］研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可緩解心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌舒張功能障礙，改善心肌結(jié)構(gòu)異常，抑制NLRP3 炎癥小體的激活、心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)并促進(jìn)細(xì)胞自噬。本研究結(jié)果顯示，H9C2 細(xì)胞經(jīng)LPS 刺激后細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1β水平以及細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)升高；在加入黃芩苷處理或PI3K/AKT 通路抑制劑后，扭轉(zhuǎn)了上述指標(biāo)的變化，提示黃芩苷對(duì)LPS造成的心肌炎癥反應(yīng)有一定的保護(hù)作用。而與黃芩苷組比較，黃芩苷+抑制組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1β水平以及NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白表達(dá)降低；黃芩苷+激活劑組上述指標(biāo)趨勢(shì)相反。

PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路是與心肌保護(hù)相關(guān)的經(jīng)典通路。研究表明，該通路的激活可以通過激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶介導(dǎo)抗細(xì)胞凋亡作用，并能夠調(diào)節(jié)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放而發(fā)揮心肌保護(hù)作用［18］。GUO 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，胡椒堿能通過上調(diào)miR-383 表達(dá)抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路來預(yù)防心肌缺血再灌注損傷中的細(xì)胞焦亡。但關(guān)于黃芩苷能否通過調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用的研究尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)LPS 刺激后，PI3K/AKT 通路相關(guān)蛋白p-PI3K、p-AKT 表達(dá)升高；而加入黃芩苷處理或PI3K/AKT通路抑制劑后，扭轉(zhuǎn)了上述指標(biāo)的變化。與黃芩苷組比較，黃芩苷+抑制劑組p-PI3K、p-AKT 蛋白表達(dá)降低，黃芩苷+激活劑組上述指標(biāo)趨勢(shì)相反。這提示黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的抑制作用可能是通過下調(diào)PI3K/AKT通路磷酸化實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，黃芩苷能夠在LPS 誘導(dǎo)的大鼠體外心肌細(xì)胞損傷模型中抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)及焦亡，其機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路激活有關(guān)。本研究從細(xì)胞功能方面揭示了黃芩苷在LPS 誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中的作用，提示黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷具有一定的治療效果。但是對(duì)于PI3K/AKT 信號(hào)通路具體如何影響細(xì)胞炎癥反應(yīng)以及焦亡尚不明確，并且LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡以及黃芩苷是否通過減輕焦亡而改善細(xì)胞活力、遷移、侵襲等，需要進(jìn)一步利用基因或藥理手段確定。