丁香酚對大鼠心肌缺血再灌注損傷的抑制作用及其機制

朱秋夢，石佳琦，呂瑋，張昕，肖云峰，2

1 內蒙古醫科大學藥學院，呼和浩特 010110；2 內蒙古醫科大學新藥安全評價研究中心

早期恢復血流是缺血性心臟病常見的治療策略。在心肌梗死及再灌注初期，心肌細胞發生壞死、凋亡，導致心肌細胞數量減少，引起心功能不全。再灌注治療可縮小心肌梗死面積，保護心肌組織，但再灌注也有可能會導致進一步的心肌損傷，也稱為心肌缺血再灌注損傷（MIRI）。缺血后處理是通過短暫的冠狀動脈閉塞反復中斷再進行灌注，可減輕再灌注損傷，從而導致心肌梗死范圍縮小［1］。MIRI涉及多種復雜的病理機制，研究顯示其與鈣超載、氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡和自噬等密切相關［2-3］。鈣通道阻滯劑地爾硫?是治療MIRI的常用藥物，其對MIRI的改善作用已被臨床證實［4］。丁香酚是一種酚類芳香族化合物，主要從丁香油中獲得，具有良好的抗炎、抗氧化作用，臨床上可用于心肌缺血類疾病的治療。本課題組前期研究顯示，丁香酚能夠有效改善MIRI大鼠的心功能，并且發現其可通過抑制心肌細胞凋亡［5］、降低心肌細胞氧化應激水平［6］及增強心肌細胞能量代謝［7］來延緩MIRI的發展，但丁香酚在基因水平抑制MIRI的作用機制尚不明確。轉錄組測序技術可以定量、準確的確定RNA的表達水平，并能夠通過對研究結果的比較確定細胞群中每一個分子的絕對數量［8］。由于外界刺激或環境變化時生物體中基因表達水平變化微小，2022年4月—8月，本研究采用轉錄組測序技術分析丁香酚作用于MIRI的差異表達基因，從轉錄組學水平進一步揭示MIRI的相關調控蛋白，以期闡明丁香酚改善MIRI的具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 清潔級Wistar 大鼠60 只，體質量（200 ± 20）g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，實驗動物生產許可證：SCXK（京）2019-0010。丁香酚（上海源葉生物科技有限公司），鹽酸地爾硫?（天津田邊制藥有限公司），烏拉坦（上?？低鼗び邢薰荆籘ruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit（美國Illumina），Qubit RNA Assay Kit（美國Life Technologies），Bioanalyzer 2100 RNA-6000 Nano Kit（美國Aglient），Bioanalyzer 2100 DNA-1000 Kit（美國Aglient），SuperScript Ⅱ Reverse Transcriptase（美國Invitrogen），乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、肌酸激酶（CK）試劑盒、肌酸激酶同工酶（CK-MB）試劑盒（寧波美康生物科技股份有限公司）；臺式離心機（德國Eppendorf），PCR儀（美國Bio-Rad）；紫外分光光度計（美國Thermo），定量儀（美國Invitrogen）。

1.2 動物分組處理與建模 健康Wistar 大鼠60只，隨機分為假手術組、MIRI 組、丁香酚低劑量組、丁香酚中劑量組、丁香酚高劑量組、陽性對照組，每組10只。丁香酚低劑量組、丁香酚中劑量組、丁香酚高劑量組、陽性對照組分別給予50、100、200 mg/（kg·d）丁香酚及30 mg/（kg·d）鹽酸地爾硫?灌胃，假手術組、MIRI組給予普通人羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，每日1次，共給藥14 d。除假手術組外，各組均于末次給藥1 h后采用結扎冠狀動脈左前降支法建立大鼠MIRI模型。腹腔注射20%烏拉坦麻醉大鼠，仰臥位固定，使用生物機能實驗系統記錄其正常Ⅱ導聯心電圖。待心電穩定后連接小動物呼吸機，消毒左側胸前及腋下皮膚，備皮。使用乳突撐開器于大鼠左側第3、4肋間撐開胸廓暴露心臟。使用7-0帶線縫合針在距冠狀動脈左前降支2 mm處進針，在結扎處墊一硅膠管，而后將冠狀動脈左前降支及硅膠管一起結扎。術中監測Ⅱ導聯心電圖ST段變化，心電圖結果表明，大鼠進行血管結扎手術后ST段抬高，提示心肌缺血模型建立成功。30 min后松開結扎線，取出結扎線和硅膠管，從內向外逐層縫合，再灌注24 h。假手術組開胸后，在冠狀動脈左前降支處僅穿線不結扎。

1.3 血清心肌損傷標志物檢測 取各組大鼠腹主動脈血，采血管靜置30 min，3 500 r/min 離心10 min取血清。采用全自動生化分析儀檢測血清心肌損傷標志物CK、CK-MB、LDH。

1.4 心肌梗死面積比測定 采血結束后，快速摘取大鼠心臟，將其切成4～5 片，置于0.05%的TTC 溶液中，37 ℃恒溫水浴振搖染色10～15 min。將其取出，洗去多余染料；心肌片按順序排好并拍照，應用Image J 軟件分析計算左心室面積及梗死區面積。心肌梗死面積比以梗死區心肌面積占左心室面積的百分比表示。

1.5 丁香酚作用于MIRI的差異表達基因篩選 采用轉錄組測序篩選丁香酚作用于MIRI 的差異表達基因。各組隨機取3份心臟組織，用0.9%氯化鈉溶液沖洗多余血跡，于液氮中速凍，放置在-80 ℃冰箱保存。提取心臟組織總RNA 并使用DNase 消化DNA 后，用帶有Oligo 的磁珠富集真核生物mRNA；加入打斷試劑將mRNA 打斷成短片段，以打斷后的mRNA 為模板，用六堿基隨機引物合成一鏈cDNA，然后配制二鏈成反應體系合成二鏈cDNA，并使用試劑盒純化雙鏈cDNA；純化的雙鏈cDNA 再進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，進行片段大小選擇并進行PCR 擴增；構建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer 質檢合格后，使用Illumina HiSeqTM2500 或Illumina HiSeq X Ten等測序儀進行測序，產生125 bp或150 bp 的雙端數據。質檢合格后，使用Illumina測序儀進行測序。先使用Trimmomatic［9］軟件進行質控并去除接頭，在此基礎上過濾掉低質量堿基以及N 堿基，最終得到高質量的clean reads。將clean reads 使用hisat2［10］比對到物種的參考基因組，軟件參數為默認參數，通過基因組比對率來評估樣本的情況。通過eXpress［11］軟件獲取落到各個心臟組織中轉錄本的reads 數目，使用DESeq［12］（2012） R package 的estimateSizeFactors 函數對數據進行標準化，并使用nbinomTest 函數計算差異比較的P值和foldchange 值。挑選出P＜0.05，差異倍數＞2 的差異轉錄本作為丁香酚作用于MIRI的差異表達基因。

1.6 差異表達基因的GO功能及KEGG信號通路富集分析 對轉錄組測序篩選出的差異表達基因進行GO 功能及KEGG 信號通路富集分析［13］，其中GO 分析包括生物過程、分子功能及細胞組分。

1.7 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件及GraphPad Prism8.0繪圖軟件。計量資料采用K-S檢驗進行正態性分析，符合正態分布的資料以表示，組間比較行獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清心肌損傷標志物CK、CK-MB、LDH 比較 血清心肌損傷標志物CK、CK-MB、LDH水平MIRI組＞丁香酚低劑量組、丁香酚中劑量組、丁香酚高劑量組、陽性對照組＞假手術組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組血清CK、CK-MB、LDH比較（U/L，）

表1 各組血清CK、CK-MB、LDH比較（U/L，）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與MIRI組比較，#P＜0.05。

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2.2 各組心肌梗死面積比比較 假手術組、MIRI組、丁香酚低劑量組、丁香酚中劑量組、丁香酚高劑量組、陽性對照組心肌梗死面積比分別為0、36.63% ± 0.11%、28.43% ± 0.05%、17.60% ±0.03%、17.47% ± 0.01%、22.27% ± 0.06%；心肌梗死面積比假手術組＞丁香酚低劑量組、丁香酚中劑量組、丁香酚高劑量組、陽性對照組＞MIRI 組（P均＜0.05）。

2.3 丁香酚作用于MIRI 的差異表達基因篩選結果 與MIRI 組比較，丁香酚低劑量組共有1 035 個差異表達基因，其中594 個基因上調、441 個基因下調；丁香酚中劑量組共有513個差異表達基因，其中197 個基因上調、316 個基因上調；丁香酚高劑量組共有1 962 個差異表達基因，其中1 151 個基因上調、、811個基因下調。見OSID碼圖1。

2.4 差異表達基因的GO 功能富集分析結果 丁香酚低劑量組與MIRI組差異表達基因的GO分析結果顯示，丁香酚作用于MIRI的生物過程主要涉及免疫反應、對脂多糖的反應、T 淋巴細胞增殖的正調控、病毒基因組復制的負調控等；細胞組分主要涉及細胞外空間、細胞表面、質膜外側等；分子功能主要涉及趨化因子的活動、聚糖綁定、肽聚糖綁定、信號受體結合等（OSID 碼圖2）。丁香酚中劑量組與MIRI 組差異表達基因的GO 分析結果顯示，丁香酚作用于MIRI的生物過程主要涉及對細菌的反應、病毒基因組復制的負調控、氧氣輸送以及核糖核酸酶活性的調節等；細胞組分主要涉及細胞外空間、血紅蛋白復合體、染色體、著絲粒區以及著絲粒等；分子功能主要涉及低聚腺苷酸合成酶活性、載氧活性、血紅素結合、信號受體結合等（OSID 碼圖3）。丁香酚高劑量組與MIRI組差異表達基因的GO分析結果顯示，丁香酚作用于MIRI的生物過程主要涉及急性期反應、氧氣輸送、細胞群體增殖的正調控、細胞群體增殖的負調控等；細胞組分主要涉及細胞外空間、細胞外基質、C/D RNP 復合體等；分子功能主要涉及微管運動活動、信號受體活性、載氧活性、鈣離子結合等（OSID碼圖4）。

2.5 差異表達基因的KEGG 信號通路富集分析結果 丁香酚低劑量組與MIRI 組差異表達基因的KEGG 分析結果顯示，丁香酚作用下差異表達基因主要涉及細胞因子—細胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、NOD 樣受體信號通路、TNF 信號通路等過程（OSID 碼圖5）。丁香酚中劑量組與MIRI組差異表達基因的KEGG 分析結果顯示，丁香酚作用下差異表達基因 主要涉及1 型糖尿病、抗原處理和呈遞、自身免疫性甲狀腺疾病、FOXO 信號通路等過程（OSID 碼圖6）。丁香酚高劑量組與MIRI 組差異表達基因的KEGG 分析結果顯示，丁香酚作用下差異表達基因主要涉及HIF-1 信號通路、AGERAGE 信號通路、PI3K-AKT 信號通路，JAK-STAT 信號通路等過程（OSID碼圖7）。

3 討論

心肌缺血是中老年人的高危疾病。溶栓治療后，心臟組織可能會遭受進一步的損害，即MIRI［14］。MIRI 的治療方法主要包括非藥物干預（缺血預處理）和藥物治療［15］。本課題組前期研究顯示，丁香酚可對MIRI產生保護作用，但目前在基因層面對其分子機制研究較少。本研究結果顯示，通過結扎大鼠冠狀動脈左前降支30 mim，再灌注24 h 可使大鼠心電信號ST 段抬高，顯示模型建立成功。心肌缺血后，心肌細胞受損，由于細胞膜破裂，細胞中的酶被釋放出細胞。通過測量血清或培養基中的酶含量，可以評估心肌細胞損傷的程度。血清中LDH、CK、CK-MB 水平可直接反映大鼠心功能損傷的嚴重程度［16］。本研究結果表明，與MIRI 組比較，丁香酚各劑量組大鼠血清中LDH、CK、CK-MB 水平均在不同程度上有所降低，提示丁香酚可以減輕大鼠MIRI，降低心肌組織損傷標志物LDH、CK、CK-MB水平。

超低溫取各組大鼠的心臟組織，提取其RNA 進行轉錄組測序顯示，丁香酚低、中、高劑量組可分別對MIRI 大鼠產生1 035、513、1 962 個差異表達基因，其中丁香酚高劑量組差異基因表達數量最多，有個811 下調基因，1 151 個上調基因。這提示丁香酚對MIRI 的改善作用調用了許多具有廣泛功能的基因。

丁香酚作用于MIRI差異表達基因的GO功能富集分析中，丁香酚各劑量給藥組主要涉及生物調節、細胞過程以及刺激反應等功能。本課題組在丁香酚各劑量組作用于MIRI 的差異表達基因中檢索心臟相關差異表達基因，并未得到內容，但得到一個與線粒體和自噬相關的差異表達基因Bnip3。在測序結果中，Bnip3于MIRI組基因表達上調。有研究表明，Bnip3 可以通過觸發保護性應激反應，上調細胞自噬及去除受損的線粒體，從而改善MIRI［17］。Bnip3在GO 分析與缺氧反應、線粒體、心肌細胞凋亡過程的正調控、程序性細胞死亡的調控、線粒體碎片參與凋亡過程、線粒體自噬的正調控、有氧呼吸的調控、內在凋亡信號通路對缺氧的響應有關。這提示丁香酚可能通過提高心臟組織中Bnip3 的表達，在缺氧條件下通過上調線粒體自噬來清除受損線粒體，維持機體內環境穩定，從而緩解MIRI進展。丁香酚作用于MIRI 差異表達基因的KEGG 信號通路富集分析中，丁香酚各劑量給藥組主要涉及JAK-STAT 信號通路、PI3K-AKT 信號通路信號通路、HIF-1α 信號通路等。該結果與本研究團隊前期研究結果一致，即丁香酚可能通過抑制心肌細胞凋亡、降低心肌細胞氧化應激水平及增強心肌細胞能量代謝來緩解MIRI 的發展。與MIRI 組比較，缺氧誘導因子HIF-1信號通路在丁香酚高劑量組上調趨勢中富集得分最高且差異最明顯。有研究發現，MIRI大鼠血清HIF-1α水平顯著升高［18］，即HIF-1α 及其信號通路在MIRI中起到促進作用。而丁香酚干預可改變HIF-1 信號通路在心臟組織中的表達趨勢，提示丁香酚可能通過調控HIF-1 信號通路來緩解MIRI 的發展，但其對HIF-1 信號通路的具體機制值得進一步研究。除此之外，FOXO 信號通路，PI3K-AKT 信號通路、鐵死亡以及原發性免疫缺陷都與MIRI具有一定的相關性，值得進一步研究。

綜上所述，丁香酚可抑制大鼠MIRI，其分子機制可能與HIF-1 信號通路有關。下一步可針對丁香酚通過HIF-1 信號通路緩解MIRI 的具體機制進行進一步研究，以期為MIRI的藥理學預防提供更多理論依據。