基于形態(tài)學(xué)和宏基因組學(xué)的養(yǎng)殖蟹塘浮游植物群落分析

張 旭 ，周 麗，蔡 敏，崔娜欣，鄒國(guó)燕，趙志勇，袁 泉，黃偉偉，張亞雷

1. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所/上海低碳農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 201403

2. 同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院/污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200092

3. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海 201403

中華絨螯蟹 (Eriocheirsinensis) 俗稱(chēng)河蟹，是我國(guó)重要的淡水名特優(yōu)養(yǎng)殖對(duì)象，目前池塘養(yǎng)殖是我國(guó)中華絨螯蟹的主要養(yǎng)殖模式[1]。養(yǎng)殖池塘作為一個(gè)相對(duì)封閉的生態(tài)系統(tǒng)，浮游植物的群落結(jié)構(gòu)及演替規(guī)律在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有重要作用。浮游植物不僅可作為養(yǎng)殖產(chǎn)品的天然餌料，對(duì)水質(zhì)控制也有重要作用，進(jìn)而影響水產(chǎn)養(yǎng)殖的生產(chǎn)力[2]。因此，研究養(yǎng)殖期間浮游植物群落的時(shí)空變化規(guī)律可為養(yǎng)殖過(guò)程中的水質(zhì)管理提供重要參考。

目前常用的浮游植物分類(lèi)和鑒定技術(shù)主要有基于細(xì)胞形態(tài)的鑒定 (如：顯微鏡技術(shù))、基于特征性化學(xué)物質(zhì)的鑒定 (如：高效液相色譜法) 和基于分子生物學(xué)技術(shù)的鑒定 (如：特異性探針)[3]。現(xiàn)針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中浮游植物群落結(jié)構(gòu)的分析大多采用基于細(xì)胞形態(tài)的人工鏡檢方法[4-6]。傳統(tǒng)的浮游植物群落結(jié)構(gòu)分析方法的局限性在于受人工經(jīng)驗(yàn)的影響較大，對(duì)研究者的鑒定技術(shù)水平有較高要求；而且人工鏡檢對(duì)一些形態(tài)相似、細(xì)胞較小或豐度較低的類(lèi)群難以識(shí)別和鑒定[7]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外學(xué)者越來(lái)越多地利用高通量測(cè)序技術(shù)研究環(huán)境中存在的各種微生物，尤其是宏基因組學(xué)技術(shù)，其研究對(duì)象為特定環(huán)境中的總DNA，檢測(cè)速度快、檢出限低，可極大地拓展對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中浮游植物的鑒定和認(rèn)識(shí)[8]。目前針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖水體，已有部分研究利用高通量測(cè)序技術(shù)研究養(yǎng)殖環(huán)境中的細(xì)菌多樣性[9-10]，而有關(guān)高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中浮游植物群落結(jié)構(gòu)特征及演替規(guī)律的研究還較少[11-12]。

本研究利用基于形態(tài)學(xué)的人工鏡檢方法和基于高通量測(cè)序技術(shù)的宏基因組組學(xué)方法，共同調(diào)查2022 年6—10 月中華絨螯蟹養(yǎng)殖池塘中水體浮游植物群落的組成及多樣性，比較分析兩種方法所得結(jié)果的差異，探討浮游植物群落結(jié)構(gòu)特征與環(huán)境因子的關(guān)系；以期為更全面、準(zhǔn)確地研究養(yǎng)殖蟹塘浮游植物群落結(jié)構(gòu)及其演替規(guī)律提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣地點(diǎn)與養(yǎng)殖情況

采樣地點(diǎn)位于上海市崇明區(qū)某中華絨螯蟹養(yǎng)殖基地 (121°24'E, 31°74'N)，蟹塘長(zhǎng)140 m、寬85 m，總面積1.19 hm2，回水通道2.8 m，水深0.7～1.0 m，底泥厚度30 cm。池塘內(nèi)種植伊樂(lè)藻 (Elodeanuttallii)和苦草 (Vallisnerianatans)，覆蓋面積約70%。池塘內(nèi)配備1 臺(tái)5 kW 曝氣機(jī)，每天曝氣6 h；配備8 臺(tái)3 kW 推流機(jī)，在夏季高溫期 (8 月) 同時(shí)開(kāi)啟3 臺(tái)，每天運(yùn)行3～4 h，保證充足的溶解氧(DO)。2022 年3 月10 日放苗，放養(yǎng)密度為1.5萬(wàn)只·hm?2。4—6 月，每天投喂餌料7.5～15 kg·hm?2，6—10 月，每天投喂餌料30～45 kg·hm?2。養(yǎng)殖期結(jié)束時(shí)，蟹產(chǎn)量為1 200 kg·hm?2，成活率約50%。

1.2 樣品采集與測(cè)定

2022 年6—10 月逐月采集養(yǎng)殖池塘的水樣及浮游植物樣品。池塘沿對(duì)角線設(shè)置3 個(gè)采樣點(diǎn)，用5 L 有機(jī)玻璃采水器采集水面以下0.5 m 處各點(diǎn)水樣及浮游植物樣品。pH、水溫 (Water temperature, WT)、DO 等指標(biāo)通過(guò)多參數(shù)水質(zhì)分析儀 (哈希，HQ 4300) 現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定；葉綠素a(Chl-a)、總磷(TP)、磷酸鹽 (PO4)、總氮 (TN)、氨氮 (NH3-N)、亞硝態(tài)氮 (NO2-N)、硝態(tài)氮 (NO3-N)、高錳酸鹽指數(shù) (IMn)、五日生化需要量 (BOD5) 測(cè)定方法均參考《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》(第四版)[13]。現(xiàn)場(chǎng)取1 L 水樣加入15 mL 魯哥氏液和10 mL 40% (φ)的甲醛溶液固定，帶回實(shí)驗(yàn)室靜置48 h 后濃縮至50 mL，然后用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行物種鑒定和計(jì)數(shù)。浮游植物取樣及計(jì)數(shù)具體方法參考中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站發(fā)布的《水生態(tài)監(jiān)測(cè)計(jì)數(shù)要求 淡水浮游植物》(試行)，浮游植物種類(lèi)鑒定參考《水生生物學(xué)》(第二版)[14]。

3 個(gè)取樣點(diǎn)各取200 mL 水樣后經(jīng)0.22 μm 濾膜抽濾，過(guò)濾后的濾膜用液氮冷凍后放置于?80 ℃冰箱保存，樣品最終送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行宏基因組測(cè)序。具體方法如下：抽提濾膜上截留物的DNA，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)評(píng)估。DNA 樣本檢測(cè)合格后，將其隨機(jī)片段化并篩選合適大小的插入片段進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。構(gòu)建好的文庫(kù)質(zhì)檢合格并精確定量后，上機(jī)進(jìn)行Illumina NovaSeq 6000 宏基因組測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 浮游植物密度及生物量分析

浮游植物密度、生物量參照《水生生物學(xué)》(第二版)[14]中的濃縮計(jì)算法以及浮游植物細(xì)胞平均濕質(zhì)量結(jié)合密度計(jì)算得到。

1.3.2 浮游植物優(yōu)勢(shì)種及多樣性指數(shù)

針對(duì)人工觀察計(jì)數(shù)浮游植物多樣性參數(shù)的計(jì)算公式為[15]：

式中：ni為第i個(gè)種的數(shù)量；N為浮游植物總數(shù)量；fi為第i個(gè)種出現(xiàn)的頻率；S為浮游植物總種數(shù)。將Y≥0.02 的浮游植物定義為優(yōu)勢(shì)種。

1.3.3 理化指標(biāo)及人工鏡檢數(shù)據(jù)分析

通過(guò)SPSS 20.0 軟件的單因素方差分析 (Oneway ANOVA) 對(duì)池塘水質(zhì)理化指標(biāo)進(jìn)行分析，不同因素間的多重比較采用Duncan 檢驗(yàn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，顯著性水平P=0.05；人工鏡檢所得的浮游植物結(jié)果，通過(guò)PRIMER 6.1.13軟件[16]對(duì)浮游植物多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，并利用R 語(yǔ)言 (version 4.3.0) Vegan 包 (https://CRAN.Rproject.org/package=vegan)對(duì)浮游植物和養(yǎng)殖池塘水環(huán)境因子進(jìn)行典型關(guān)聯(lián)分析 (Canoni-cal correlation analysis, CCA)。

1.3.4 宏基因組數(shù)據(jù)分析

對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾處理，去除污染及低質(zhì)量數(shù)據(jù)、污染序列等，得到有效數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)拼接組裝并統(tǒng)計(jì)組裝結(jié)果。對(duì)重疊群進(jìn)行基因預(yù)測(cè)并去冗余，構(gòu)建基因目錄，與NR (nr_202109)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì) (BLASTP)，物種注釋方法為Besthit，獲得物種注釋信息，并計(jì)算物種豐度。在基因集中篩選浮游植物藍(lán)藻門(mén)、硅藻門(mén)、綠藻門(mén)、裸藻門(mén) (僅包括植物界中的裸藻目)、金藻門(mén)、黃藻門(mén)、甲藻門(mén)基因構(gòu)建新的浮游植物基因集，并獲得不同物種的基因豐度表。通過(guò)Mothur 1.30[17]軟件進(jìn)行α 多樣性指數(shù)分析；基于相應(yīng)的分類(lèi)學(xué)數(shù)據(jù)表，利用R 語(yǔ)言 (version 4.3.0) 工具作圖繪制群落柱形圖；利用R 語(yǔ)言Vegan 包進(jìn)行冗余分析 (Redundancy analysis, RDA)。不同月份養(yǎng)殖水體中的所有微生物基因組原始數(shù)列已上傳至NCBI (登錄號(hào)：PRJNA983 952)。

2 結(jié)果

2.1 養(yǎng)殖蟹塘水質(zhì)指標(biāo)

養(yǎng)殖蟹塘在養(yǎng)殖中后期 (6—10 月) 的水質(zhì)指標(biāo)見(jiàn)表1。在此期間，不同月份間的水質(zhì)指標(biāo)均存在顯著性差異 (P＜0.05)。其中，6 月pH、DO、BOD5最高；7 月WT、Chl-a最高；6—8 月高溫期，PO4、TN、NH3-N、NO2-N、IMn 均在8 月出現(xiàn)高值；8 月的DO 顯著高于7 月(P＜0.05)；而9—10 月低溫期，TP、PO4、NO3-N、IMn、BOD5出現(xiàn)高值。根據(jù)GB 11607《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》 和 GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》的III 類(lèi)水標(biāo)準(zhǔn)，該養(yǎng)殖塘在養(yǎng)殖中后期主要超標(biāo)指標(biāo)為pH、IMn、TP 和TN。

表1 中華絨螯蟹養(yǎng)殖池塘水體理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical parameters in water bodies of E. sinensis aquaculture ponds

2.2 人工鏡檢浮游植物的組成及與環(huán)境因子的關(guān)系

在養(yǎng)殖中后期通過(guò)人工鏡檢共鑒定出浮游植物4 門(mén)65 種。其中，藍(lán)藻門(mén)9 種，綠藻門(mén)36 種，硅藻門(mén)11 種，裸藻門(mén)9 種。7 月浮游植物種類(lèi)數(shù)量最多 (圖1-a)，優(yōu)勢(shì)類(lèi)群主要為綠藻門(mén)。以優(yōu)勢(shì)度指數(shù)Y≥0.02 定為優(yōu)勢(shì)種，養(yǎng)殖中后期的優(yōu)勢(shì)種主要為藍(lán)藻門(mén)的水華微囊藻 (Microcystisflos-aquae)、細(xì)小隱球藻(Aphanocapsaelachista)、挪氏微囊藻(M.novacekii)、綠藻門(mén)的水綿 (Spirogyrasp.)、方形十字藻 (Crucigeniarectangularis)、硅藻門(mén)的中肋骨條藻 (Skeletonemacostatum)和裸藻門(mén)的敏捷扁裸藻(Phacusagilis) (表2)。其中，6、7 和9 月以藍(lán)藻門(mén)的水華微囊藻為主要優(yōu)勢(shì)藻，8 月以藍(lán)藻門(mén)的細(xì)小隱球藻為主要優(yōu)勢(shì)藻，10 月以硅藻門(mén)的中肋骨條藻為主要優(yōu)勢(shì)藻。

圖1 不同月份的浮游植物種類(lèi)數(shù)量、密度、生物量和多樣性指數(shù)Fig. 1 Species composition, density, biomass and diversity index of plankton in different months

表2 中華絨螯蟹養(yǎng)殖池塘浮游植物優(yōu)勢(shì)種優(yōu)勢(shì)度Table 2 Dominance index of phytoplankton dominant species in aquaculture pond of E. sinensis

浮游植物密度和生物量變化見(jiàn)圖1-b—1-c。養(yǎng)殖中后期浮游植物密度最高值出現(xiàn)在7 月 (2 656.38×107個(gè)·L?1)，其次為9 月 (21.97×107個(gè)·L?1)，均顯著高于其他月份(P＜0.05)且以藍(lán)藻門(mén)為主。浮游植物生物量同樣為7 月最高 (267.54 mg·L?1)，其次為9 月 (3.51 mg·L?1)，均顯著高于其他月份 (P＜0.05)且均以藍(lán)藻門(mén)為主。8 月浮游植物的密度和生物量顯著降低，其中藍(lán)藻門(mén)的藻細(xì)胞密度最大(2.52×105個(gè)·L?1)，綠藻門(mén)的藻細(xì)胞生物量最小(0.03 mg·L?1)。浮游植物的Shannon-Wiener 多樣性指數(shù) (0.03～0.53) 和Pielou 均勻度指數(shù) (0.006～0.110) 具有較好的擬合度，最高值均出現(xiàn)在8 月，最低值均出現(xiàn)在9 月；Margalef 豐富度指數(shù) (0.83～1.84) 最低值同樣出現(xiàn)在9 月，最高值出現(xiàn)在10 月(圖1-d)。

利用R 語(yǔ)言對(duì)人工鏡檢所得浮游植物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行去趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析 (Detrended correspondence analysis，DCA，圖2)，得出第一軸梯度長(zhǎng)度為5.15(＞4.0)，因此選擇對(duì)群落結(jié)構(gòu)與水環(huán)境因子進(jìn)行CCA 分析。利用方差膨脹因子分析，保留膨脹因子小于10 的環(huán)境因子 (pH、DO、Chl-a、TN、NH3-N、NO3-N、IMn、BOD5)。CCA1 和CCA2 軸的特征值分別為0.97 和0.96，兩軸的約束解釋量分別為49.54%和48.74%，共解釋了98.28%的浮游植物群落變異程度。利用ANOVA 顯著性分析，基于類(lèi)方差排列檢驗(yàn) (ANOVA like permutation test, number of permutations=999)，得出DO (F=58.45,P=0.001)、Chl-a(F=25.30,P=0.001)、TN (F=59.85,P=0.001)、NH3-N (F=53.60,P=0.001)是對(duì)浮游植物優(yōu)勢(shì)種影響最顯著的環(huán)境因子，這些因子分別貢獻(xiàn)了總解釋量的4.00%、8.44%、40.28%和39.52%，貢獻(xiàn)最大的環(huán)境因子是TN 和NH3-N。由圖2 可知，主要驅(qū)動(dòng)因子中DO、NO3-N 和TN 與CCA1軸呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.43、0.41 和0.34，藍(lán)藻門(mén)中的細(xì)小隱球藻、挪氏微囊藻和綠藻門(mén)中的水綿、方形十字藻的豐度與DO、NO3-N 和TN 的濃度密切相關(guān)；而pH 和Chl-a與CCA1 軸呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.24 和0.39，隨著pH 和Chl-a的增加，藍(lán)藻中的水華微囊藻成為優(yōu)勢(shì)藻；而硅藻門(mén)中的中肋骨條藻和裸藻門(mén)中的敏捷扁裸藻的豐度與BOD5、NO3-N、DO 密切相關(guān)。

圖2 養(yǎng)殖蟹塘浮游植物優(yōu)勢(shì)種與環(huán)境因子的CCA 排序分析Fig. 2 CCA ordination of phytoplankton dominant species and environmental factors in aquaculture pond of E. sinensis

2.3 宏 基因組測(cè)序浮游植物組成及與環(huán)境因子的關(guān)系

分析宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)可得，在養(yǎng)殖蟹塘的浮游植物中，共篩選出藍(lán)藻門(mén)、綠藻門(mén)、硅藻門(mén)和裸藻門(mén)4 門(mén) (圖3-a)，其中在種水平上分析可知藍(lán)藻門(mén)共包含1 181 種，綠藻門(mén)183 種，硅藻門(mén)89 種，裸藻門(mén)10 種，優(yōu)勢(shì)種類(lèi)為藍(lán)藻門(mén)和綠藻門(mén)。圖3-a顯示，除9 月以綠藻門(mén) (占64.62%) 為主外，6、7、8 和10 月均以藍(lán)藻門(mén)為主，分別占比92.77%、99.48%、88.17%和67.13%。10 月綠藻門(mén)和硅藻門(mén)占比分別為4.20%和28.49%。浮游植物基因豐富度、均勻度和多樣性分別用Chao、Shannoneven 和Shannon 表示 (圖3-b)。6—10 月浮游植物基因豐富度指數(shù)介于226～294，最高值出現(xiàn)在7 月，最低值出現(xiàn)在9 月；群落均勻度指數(shù)介于0.19～0.62，最高值出現(xiàn)在6 月，最低值出現(xiàn)在7 月；群落多樣性指數(shù)介于1.08～3.34，最高值出現(xiàn)在6 月，最低值出現(xiàn)在7 月。

圖3 浮游植物門(mén)水平各群落組成(a)、多樣性指數(shù)(b)、藍(lán)藻門(mén)、綠藻門(mén)、硅藻門(mén)和裸藻門(mén)屬水平各群落組成(c—f)Fig. 3 Percent ages of community abundance at phylum level (a) and diversity indices of plankton (b), percent of community abundance at genus level of Cyanophyta, Chlorophyta, Bacillariophyta, and Euglenophyta (c—f) in different months

養(yǎng)殖蟹塘的浮游植物在屬水平上共鑒定出藍(lán)藻門(mén)180 屬、綠藻門(mén)115 屬、硅藻門(mén)52 屬和裸藻門(mén)6 屬(圖3-c—3-f)。藍(lán)藻門(mén)中微囊藻屬在6、7、8、9 和10 月的占比分別為11.43%、81.00%、18.96%、4.73%和3.51%，可見(jiàn)微囊藻屬在7 月為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)屬。6 月占比最多的為聚球藻屬 (Synechococcus,15.17%)；8 月除微囊藻屬 (18.96%) 外，束絲藻屬(Aphanizomenon)占比較多 (17.85%)；9、10 月的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)屬均為束絲藻屬，占比分別為82.36%、48.46%。綠藻門(mén)中6、7 月占比較多的均為四豆藻屬 (Tetrabaena)和衣藻屬 (Chlamydomonas)，分別為25.96%、25.95%和20.16%、22.74%；8、9 月團(tuán)藻屬 (Volvox)占比最多，分別為19.15%、60.15%；10 月衣藻屬和四豆藻屬占比較多，分別為22.70%和20.15%。硅藻門(mén)中6、7、8、9 和10 月占比最多的均為海鏈藻屬(Thalassiosira)，分別為65.61%、34.29%、53.97%、70.24%和68.87%。裸藻門(mén)中6、7 月未注釋到相關(guān)物種，8、9 月占比最多的均為旋形藻屬 (Monomorphina)，并且9 月只注釋到此屬；1 0 月占比最多的為裸藻屬 (Euglena,83.03%)。從種水平上分析，6、8、9、10 月的優(yōu)勢(shì)種均為水華束絲藻 (A.flos-aquae)，7 月為銅綠微囊藻 (表3)。

表3 中華絨螯蟹養(yǎng)殖池塘浮游植物優(yōu)勢(shì)種占比Table 3 Composition of phytoplankton dominant species in aquaculture pond of E. sinensis

利用R 語(yǔ)言對(duì)宏基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建的浮游植物優(yōu)勢(shì)物種進(jìn)行去DCA 分析(圖4)，得出第一軸梯度長(zhǎng)度為1.86 (＜4.0)，因此選擇對(duì)群落結(jié)構(gòu)與水環(huán)境因子進(jìn)行RDA 分析。利用方差膨脹因子分析，保留膨脹因子小于10 的環(huán)境因子(pH、DO、Chl-a、TN、NH3-N、NO3-N、IMn、BOD5)。RDA1 和RDA2 軸的特征值分別為0.19 和0.07，兩軸的約束解釋量分別為59.15%和21.57%，共解釋了80.72%的浮游植物群落變異程度。利用ANOVA 顯著性分析，基于類(lèi)方差排列檢驗(yàn)，得出 pH (F=167.81,P=0.001)、DO (F=91.60,P=0.001)、Chl-a(F=169.49,P=0.001)、TN (F=42.54,P=0.001)、NH3-N(F=76.72,P=0.001)和NO3-N (F=58.12,P=0.001) 是影響浮游植物優(yōu)勢(shì)種最顯著的環(huán)境因子，這些因子分別貢獻(xiàn)了總解釋量的37.12%、3.50%、19.29%、7.47%、16.26%和10.82%，貢獻(xiàn)最大的環(huán)境因子為pH 和Chl-a。由圖4 可知，主要驅(qū)動(dòng)因子中NO3-N 與RDA1 呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.89，沿著第一排序軸RDA1 正方向，隨著NO3-N 含量升高，藍(lán)藻門(mén)中的水華束絲藻和綠藻門(mén)中的非洲團(tuán)藻 (V.africanus)、網(wǎng)狀團(tuán)藻 (V.reticuliferus) 豐度增加；而pH 和Chl-a與第一排序軸RDA1 呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.58 和0.47，隨著pH 和Chl-a的增加，藍(lán)藻中的微囊藻屬為優(yōu)勢(shì)藻；而硅藻門(mén)中海鏈藻屬的豐度與BOD5和DO 密切相關(guān)。

圖4 養(yǎng)殖蟹塘浮游植物優(yōu)勢(shì)種與環(huán)境因子的RDA 排序分析Fig. 4 RDA ordination of phytoplankton dominant species and environmental factors in aquaculture pond of E. sinensis

3 討論

3.1 人工鏡檢與宏基因組測(cè)序結(jié)果對(duì)比

通過(guò)人工鏡檢和宏基因組學(xué)分析得出浮游植物種類(lèi)的數(shù)量和類(lèi)別存在顯著性差異。通過(guò)宏基因組學(xué)所得的浮游植物種類(lèi)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于人工鏡檢，在種水平上為人工鏡檢的22.51 倍；兩種方法檢出的每月的優(yōu)勢(shì)種完全不同，甚至10 月所鑒定出的優(yōu)勢(shì)種屬于不同門(mén)。需要重點(diǎn)指出的是，人工鏡檢法所得10 月的優(yōu)勢(shì)藻為中肋骨條藻，被認(rèn)為是一種廣溫、廣鹽的近岸型硅藻，最適增殖溫度和鹽度范圍分別為24～28 ℃和20‰～30‰[18]，是長(zhǎng)江口及其鄰近海域最常見(jiàn)的赤潮種[19]。本研究的取樣點(diǎn)為位于長(zhǎng)江口的上海市崇明區(qū)，鹽度范圍為0.1‰～0.3‰，顯然不是中肋骨條藻的最適增殖條件。近年來(lái)相關(guān)研究報(bào)道，骨條藻在一些淡水環(huán)境中，如太湖、鄱陽(yáng)湖、蘇州河中被頻繁檢出，并在某一時(shí)期成為優(yōu)勢(shì)種，但關(guān)于淡水骨條藻的研究較少[20]，因此不排除淡水養(yǎng)殖蟹塘中存在骨條藻成為優(yōu)勢(shì)種的可能性。而且，宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)分析所得的10 月的優(yōu)勢(shì)藻海鏈藻同樣為近海咸淡水浮游種類(lèi)，這充分說(shuō)明10 月此養(yǎng)殖蟹塘具備咸淡水藻類(lèi)成為優(yōu)勢(shì)種的條件。主要原因可能是上海市崇明區(qū)養(yǎng)殖蟹塘處于長(zhǎng)江入海口的咸淡水交界處[21]。

從數(shù)值上比較，宏基因組學(xué)所得的多樣性指數(shù)高于人工鏡檢所得結(jié)果，這與之前在海水池塘生態(tài)養(yǎng)殖系統(tǒng)中通過(guò)兩種方法所得的浮游植物多樣性的研究結(jié)果一致[12]。一般來(lái)說(shuō)，浮游植物的多樣性指數(shù)越高，其群落結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，穩(wěn)定性越好，但多樣性指數(shù)與水體環(huán)境質(zhì)量之間的關(guān)系較為復(fù)雜，只適合用來(lái)從某些側(cè)面進(jìn)行分析[22]。通過(guò)人工鏡檢結(jié)果對(duì)影響浮游植物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)境因子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DO、Chl-a、TN、NH3-N 是與浮游植物優(yōu)勢(shì)種群落結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)的環(huán)境因子；而通過(guò)宏基因組數(shù)據(jù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH、DO、Chl-a、TN、NH3-N、NO3-N 是優(yōu)勢(shì)種群落結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)環(huán)境因子，包含了人工鏡檢所得的關(guān)鍵環(huán)節(jié)因子。因此，雖然通過(guò)兩種分析方法所得的優(yōu)勢(shì)物種有所不同，但所得的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)環(huán)境因子存在一致性。

目前針對(duì)養(yǎng)殖水體中浮游植物的研究更多集中在基于細(xì)胞形態(tài)的傳統(tǒng)鏡檢鑒定，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)定性和定量，但是對(duì)操作者的背景要求較高，且不易檢測(cè)到超微以及低豐度的稀有類(lèi)群。而高通量測(cè)序方法可以快速評(píng)估水體中浮游植物類(lèi)群的DNA序列信息，快速檢出一些形態(tài)相似、細(xì)胞較小或豐度較低的類(lèi)群；除鑒定浮游植物種類(lèi)外，還可對(duì)群落中潛在的生物學(xué)功能進(jìn)行分析，但對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的依賴性較高，對(duì)不可培養(yǎng)的或真核浮游植物的覆蓋度相對(duì)較低，同時(shí)高通量數(shù)據(jù)積累了測(cè)序錯(cuò)誤率。本研究利用人工鏡檢和高通量測(cè)序兩種方法進(jìn)行浮游植物分析，從結(jié)果可知兩種方法各有優(yōu)劣，在某些優(yōu)勢(shì)種鑒定或者多樣性分析方面存在明顯差異，這與之前的研究結(jié)果一致[12]。建議在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中可同時(shí)采用這兩種方法，相互驗(yàn)證，以全面準(zhǔn)確地評(píng)估養(yǎng)殖水體中的浮游植物群落結(jié)構(gòu)變化情況，從總體上評(píng)判養(yǎng)殖環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)，及時(shí)實(shí)施調(diào)控措施。

3.2 養(yǎng)殖蟹塘浮游植物群落結(jié)構(gòu)特征及動(dòng)態(tài)變化

本研究通過(guò)人工鏡檢和宏基因組學(xué)研究檢測(cè)出的浮游植物主要包括藍(lán)藻門(mén)、綠藻門(mén)、硅藻門(mén)和裸藻門(mén)，且以藍(lán)藻門(mén)、綠藻門(mén)和硅藻門(mén)為主。浮游植物群落結(jié)構(gòu)會(huì)隨著養(yǎng)殖產(chǎn)品及其養(yǎng)殖環(huán)境的不同而動(dòng)態(tài)變化。已有研究均通過(guò)人工鏡檢鑒別養(yǎng)殖池塘內(nèi)的浮游植物群落，在湖北省某生態(tài)養(yǎng)魚(yú)池塘內(nèi)鑒定出浮游植物112 種，其中綠藻門(mén)、裸藻門(mén)和硅藻門(mén)為優(yōu)勢(shì)門(mén)類(lèi)[23]；在浙江省某梭子蟹綜合養(yǎng)殖池塘內(nèi)共鑒定出浮游植物81 種，其中以硅藻門(mén)、藍(lán)藻門(mén)和甲藻門(mén)為主[6]；在東北地區(qū)鹽堿養(yǎng)殖池塘內(nèi)共鑒定出浮游植物65 種，以綠藻門(mén)、藍(lán)藻門(mén)和硅藻門(mén)為主[24]；而在上海地區(qū)蘆葦?shù)居仔诽羶?nèi)共鑒定出126 種浮游植物，以綠藻門(mén)、硅藻門(mén)和藍(lán)藻門(mén)為主[25]。總體上，養(yǎng)殖池塘內(nèi)的藍(lán)藻、綠藻和硅藻檢出頻率最高，在水質(zhì)較好的養(yǎng)殖池塘內(nèi)，綠藻和硅藻為主要優(yōu)勢(shì)藻[2]，而藍(lán)藻通常在水體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富時(shí)出現(xiàn)[5,26]。總體來(lái)說(shuō)，人工鏡檢和宏基因組測(cè)序所得的優(yōu)勢(shì)藻大部分為藍(lán)藻門(mén)的微囊藻屬和束絲藻屬，證明此養(yǎng)殖蟹塘存在藍(lán)藻水華爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，并且可能產(chǎn)生藻毒素，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品造成危害，需要養(yǎng)殖戶調(diào)控水體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以防藍(lán)藻過(guò)度生長(zhǎng)。

從不同月份來(lái)看，7 月的浮游植物密度和生物量最高，且藍(lán)藻的豐度占比也最高，這也與水體中較高的Chl-a和較低的生物多樣性密切相關(guān)。值得注意的是，同樣是在養(yǎng)殖中后期的高溫期，8 月的浮游植物生物密度和生物量相較于7 月顯著降低，且生物多樣性顯著提高，這和8 月開(kāi)啟的推水過(guò)程密不可分。水體的推流過(guò)程增加了水體的DO，改善了水質(zhì)條件，減少了浮游植物過(guò)度生長(zhǎng)，這和稻田推水增氧改善水質(zhì)的原理類(lèi)似[27-28]。而在9、10 月低溫期，浮游植物種類(lèi)增加，尤其在9 月，根據(jù)宏基因組數(shù)據(jù)分析，綠藻門(mén)藻豐度占比已經(jīng)超過(guò)藍(lán)藻，是其1.84 倍；同樣，10 月浮游植物除了藍(lán)藻和綠藻外，硅藻占比也達(dá)到了28.49%。可見(jiàn)，養(yǎng)殖末期的浮游植物不僅密度和生物量顯著下降，多樣性指數(shù)在10 月也有明顯增加，水質(zhì)指標(biāo)明顯改善，比如10 月的TN、TP 均處于養(yǎng)殖中后期的最低水平。

3.3 影響?zhàn)B殖蟹塘浮游植物優(yōu)勢(shì)種的環(huán)境因子

水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中浮游植物群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化與環(huán)境因子密切相關(guān)[29]。針對(duì)相對(duì)封閉的養(yǎng)殖小水體環(huán)境，一般認(rèn)為，水體有機(jī)質(zhì)含量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)水平是影響浮游植物群落變化的主要環(huán)境因子[30-31]。本研究中，人工鏡檢和宏基因組數(shù)據(jù)分析共同認(rèn)為DO、Chl-a、TN、NH3-N 是影響浮游植物優(yōu)勢(shì)種的重要環(huán)境因子，pH 和NO3-N 是宏基因組數(shù)據(jù)分析所得的關(guān)鍵環(huán)境因子。在自然水體中，浮游植物通過(guò)光合作用釋放氧氣 (O2) 增加水體DO，水中較低的DO 同樣會(huì)抑制浮游植物生長(zhǎng)[32]。可見(jiàn)自然水體中DO 與浮游植物生物量存在顯著正相關(guān)性。但在本研究中，7 和9 月低DO 情況下測(cè)得的浮游植物生物量反而較高，一方面由于本研究中養(yǎng)殖池塘內(nèi)配備了曝氣機(jī)和推流機(jī)保證整個(gè)養(yǎng)殖中后期水體中DO 質(zhì)量濃度大于5 mg·L?1，使得浮游植物的產(chǎn)O2量對(duì)水體DO 的含量作用效果不明顯[24]；另一方面養(yǎng)殖池塘內(nèi)浮游植物生物量比如Chl-a含量還與水溫、pH 等其他指標(biāo)存在顯著相關(guān)性[33]，這解釋了本研究中DO 與Chl-a并未呈現(xiàn)正相關(guān)的可能原因。氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽是浮游植物群落的重要影響因子，本研究中發(fā)現(xiàn)兩種方法檢出的藍(lán)藻門(mén)中的優(yōu)勢(shì)微囊藻屬均與NO3-N 呈負(fù)相關(guān)，而與NH3-N 呈正相關(guān)，這可能是由于藍(lán)藻門(mén)微囊藻屬浮游植物以利用NH3-N 為主[34]。

4 結(jié)論

綜上所述，通過(guò)宏基因組學(xué)鑒定的浮游植物種類(lèi)數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)數(shù)高于人工鏡檢，在種水平上是其22.51 倍，并且兩種方法鑒定得出的不同月份的優(yōu)勢(shì)種也存在差異。總體來(lái)說(shuō)，6—8 月高溫期的優(yōu)勢(shì)種主要以藍(lán)藻為主，9—10 月逐漸過(guò)渡到藍(lán)藻與綠藻、硅藻共存。同時(shí)根據(jù)浮游植物的多樣性指數(shù)分析，宏基因組學(xué)所得的多樣性指數(shù)高于人工鏡檢所得結(jié)果。人工鏡檢和宏基因組數(shù)據(jù)分析所得影響浮游植物優(yōu)勢(shì)種的關(guān)鍵環(huán)境因子均包括DO、Chl-a、TN、NH3-N，此外，宏基因組數(shù)據(jù)分析認(rèn)為pH和NO3-N 也是影響浮游植物的關(guān)鍵環(huán)境因子。雖然通過(guò)人工鏡檢和宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)分析所得的浮游植物數(shù)量以及種類(lèi)均存在差異，但是從整體上看兩者各有優(yōu)劣，在關(guān)鍵環(huán)境因子的分析上存在一致性。因此，建議將人工鏡檢與宏基因組測(cè)序方法相結(jié)合，共同分析水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘內(nèi)浮游植物群落變化及演替規(guī)律，從而全面、快速、準(zhǔn)確地為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的藍(lán)藻水華防控及污染物去除等措施提供數(shù)據(jù)支撐。