宏基因組二代測序診斷急性Q熱并腦膜腦炎1例*

楊敏,馬晶,楊舒婷,黃國虹,王昌敏(新疆維吾爾自治區人民醫院臨床檢驗中心,烏魯木齊 830001)

Q熱(Q Fever)是一種由貝納特柯克斯體(Coxiella burnetii,Cb)引起的人畜共患病,人類Q熱的感染源主要是家畜(尤其是牛、羊)。該病原體以蜱為傳播媒介進行傳播并可以在動物體內經卵傳代,從而形成自然疫源地[1]。流行病學數據顯示,該病人群總體患病率為10.2%(1 139/11 209)[2]。Cb在常規血培養中不生長,實驗室檢查方法主要為血清學檢測、PCR檢測、病原培養等[3]。目前我院尚未常規開展上述項目,當臨床出現相關病例時,極易被忽視,誤診率和漏診率較高。本研究通過采用宏基因組二代測序(metagenomic next generation sequencing,mNGS)技術輔助診斷急性Q熱并腦膜腦炎1例,報道如下。

1 病歷資料

患者男,28歲,無業,因“發熱5 d”于2022年6月27日就診于新疆維吾爾自治區人民醫院(以下簡稱“我院”)。患者5 d前高溫勞作后出現頭痛、發熱,體溫最高39 ℃,自行口服抗生素后,頭痛緩解,但仍有發熱、乏力,伴惡心、嘔吐1次,嘔吐物為胃內容物,有腹脹、納差,否認腹痛、腹瀉,發熱病區以“發熱待查”收治入院。患者平素體健,既往有神經性皮炎病史,家族史、婚育史均無特殊,否認近期疫區流行病學史及牲畜接觸史。入院查體:體溫38.2 ℃;脈搏104次/分;呼吸23次/分;血壓128/96 mmHg,心肺未見明顯異常,神經系統查體未見明顯陽性體征。血常規示:白細胞7.01×109/L,中性粒細胞百分比76.70%,C反應蛋白72.93 mg/L;血沉28.00 mm/h;肝功能指標結果:丙氨酸氨基轉移酶(ALT)75.00 U/L、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)60.00 U/L、γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GT)160.00 U/L。肺部CT未見明顯異常,頭顱MR示雙側軟腦膜可疑強化,其余檢查無特殊。入院次日患者突發譫妄并出現自殺行為,送檢外周血及腦脊液mNGS檢測后提示Cb感染,經規范化治療后患者病情明顯好轉,未再發熱,未再出現譫妄、神經癥狀,復查肝功能指標較前有所下降,無特殊不適主訴,故于2022年7月14日出院,院外繼續口服多西環素片21 d、口服保肝藥物,監測肝功能,定期復查。

2 實驗室檢查方法及結果

2.1標本采集及前處理

2.1.1外周血采集及前處理 在患者接受抗生素治療前采血,并盡可能在寒戰或開始發熱時采血。選擇游離DNA保存管或EDTA-K2抗凝管,隨機采集患者靜脈血3～5 mL,抽血時避免溶血。采血后立即輕輕顛倒混勻8～10 次,避免凝固,混勻時動作不能太劇烈,防止溶血。8 h內將采血管置于4 ℃、4 000 r/min離心10 min,取300 μL血漿,使用核酸提取或純化試劑盒(武漢華大生物科技有限公司)進行血漿DNA提取。

2.1.2腦脊液采集及前處理 征得患者同意后,由臨床醫師采集腦脊液2 mL,立即送檢。取600 μL腦脊液加入7.2 μL溶壁酶進行酶破壁反應,在0.5 mm玻璃珠(250 μL)中進行物理破壁,混合震蕩20 min后收集300 μL樣本,使用核酸提取或純化試劑盒(武漢華大生物科技有限公司)進行腦脊液DNA提取,檢測濃度后使用基因組DNA片段化試劑盒(武漢華大生物科技有限公司)進行酶切反應,酶切產物備用。其余樣本置于-70 ℃儲存6個月以備復查,應避免反復凍融。

2.2mNGS檢測及結果 將以上兩種標本同時進行下述檢測流程,按照DNA核酸檢測試劑盒(武漢華大生物科技有限公司)說明書設置合適的溫度和循環數進行末端修復(37 ℃ 10 min;65 ℃15 min)、接頭連接(23 ℃ 20 min)、PCR擴增(98 ℃ 2 min; 98 ℃ 15 s,56 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,共12個循環;72 ℃ 5 min)、純化等一系列步驟,使用Qubit 4熒光儀及Qubit ds DNA HS Assay Kit(美國賽默飛世爾科技有限公司)檢測PCR純化產物(即文庫)的濃度。按照檢測后的PCR濃度將構建好的文庫按等質量進行pooling,將pooling混合后的文庫經環化形成單鏈環形結構,再經滾環復制生成DNB納米球。制備好的DNB納米球加載至測序芯片,使用MGISEQ-2000基因測序儀(武漢華大智造科技有限公司)進行測序[4]。測序數據下機后去除低質量的序列以獲得高質量的數據。通過BWA軟件比對將高質量數據中比對上人參考基因組序列的數據去除[5]。剩下的數據在去除低復雜度序列后與武漢華大生物科技有限公司自主研發的PMDB病原數據庫(包括6 350種細菌、1 064種真菌、4 945種病毒、234種寄生蟲)進行比對,獲得病原微生物的鑒定結果,并自動生成檢測報告及各類病原體檢出列表。

7月3日,患者血漿mNGS報告檢出Cb,嚴格比對序列數14,相對豐度36.56%,覆蓋率0.027 1%,基因組覆蓋分布圖見圖1。患者腦脊液mNGS報告未檢出任何病原體。

注:覆蓋率,檢測到的該菌核酸序列長度占該菌整個基因組序列長度的百分比;橫坐標為檢測到的該菌核酸序列在該菌整個基因組上的位置;縱坐標為每個位置上檢出該菌的序列數。圖1 Cb的基因組覆蓋分布情況

3 討論

針對發熱待查患者的診斷,檢驗科一直以來都扮演著非常重要的角色,從最基礎的血尿便常規檢查、生化檢測、微生物培養、分子檢測,到近年來應用廣泛的宏基因組二代測序技術[6],均為臨床的診斷提供了許多線索。在本案例中,患者為青年男性,急性起病,高熱不退,完善相關檢查后,自身免疫病、腫瘤性疾病、血液系統疾病診斷依據不足,遂考慮感染性疾病可能性大。患者既往無神經系統器質性問題、器質性精神障礙等病史,病程中突發譫妄并出現自殺行為,考慮中樞神經系統感染。常規實驗室檢查均未明確感染源,患者病情重且進展快,故而送檢外周血及腦脊液進行宏基因組二代測序。

本次研究在血漿中檢出Cb序列14條,樣本建庫濃度合格,且在基因組覆蓋分布圖上可看到序列分布比較分散,代表Cb整個基因組不同位置均檢測到有效序列;此外,回看檢出的其他微生物列表,均為背景菌或定植菌,未關注到其他可疑致病菌,結果較為可信。腦脊液mNGS結果報告為陰性。將結果反饋給臨床后,醫生追問患者病史,患者在烏魯木齊市南山居住長達1年,該地山林環繞,存在大量蜱蟲,不排除患者被叮咬或接觸含Cb氣溶膠的可能,為Q熱易感人群,結合患者流行病學史、臨床癥狀、體征及二代測序檢測結果,考慮診斷為急性Q熱。病程中患者出現中樞神經系統癥狀,頭顱MRI軟腦膜可疑強化,存在腦膜腦炎,雖腦脊液二代測序未檢出有效序列,但患者用藥后癥狀明顯改善,神志轉清,精神好轉,仍考慮為Q熱所致無菌性腦膜腦炎。

綜上所述,本研究通過mNGS輔助診斷了1例急性Q熱伴腦膜腦炎的患者,提示當臨床出現不明原因發熱的患者,且常規檢驗未能明確感染源時,可考慮行二代測序進行輔助診斷,為臨床醫生在缺乏有效診斷依據時提供新思路;對于高熱伴肝酶異常、出現神經癥狀的患者,常規抗感染、抗病毒治療無效時,不應忽視Q熱的篩查。