不同碘水平下甲狀腺結節患者血清外泌體中miRNA生物學標志物的篩選*

曹文源,趙鴻漸,邢浩,張輝,孔偉,劉慶華,尹峰燕,何倩,邢薇佳(1.山東第一醫科大學公共衛生與健康管理學院,a.研究生院,b.流行病學教研室,濟南 50000;.成武縣人民醫院肝膽外科,山東成武 7400;3.泰安市中心醫院 a.甲狀腺外科,b.檢驗科,山東泰安 71000;4.山東第一醫科大學第二附屬醫院 a.甲狀腺外科,b.檢驗醫學科,山東泰安 71000)

近年來隨著影像學技術的發展,臨床上超聲檢查甲狀腺結節的檢出率也在逐年上升,逐漸成為內分泌系統疾病中最常被檢出的病理因素。然而,超聲檢查存在一定的缺陷,如易受粗大鈣化偽影影響[1],且對醫師的技術水平、臨床經驗等均具有較高的要求[2]。外泌體是一種可以運載miRNA及其他物質的膜性小囊泡[3],其所攜帶的miRNA是一類小的非編碼RNA[4],可以通過調控基因表達,進而參與調控不同的生物學信號通路。因此,miRNA的改變通常能夠揭示人類機體各種疾病的發展進程,有望作為腫瘤的早期標志物。此外,碘攝入量是影響成人甲狀腺疾病發生發展的重要因素,研究證實,過多或過少攝入碘均與甲狀腺結節的形成有關[5]。因此,本研究通過分析不同碘水平的甲狀腺結節患者與健康人血清外泌體miRNA表達譜的差異,以期篩選出高靈敏且非侵入性的甲狀腺結節早期診斷血清外泌體miRNA標志物。

1 材料與方法

1.1研究對象 隨機選取2021年10月至2022年7月山東第一醫科大學第二附屬醫院及泰安市中心醫院甲狀腺外科就診的10例甲狀腺結節患者,根據其血清碘含量分為高碘水平組和正常碘水平組,每組研究對象各5例,其中女8例,男2例,年齡(49.7±12.3)歲。納入標準:(1)符合《2016版甲狀腺結節超聲指南》中規定的甲狀腺結節的診斷標準;(2)年齡≥18歲;(3)智力及精神狀態正常;(4)簽署知情同意書。排除標準:(1)采集樣本前24 h進食碘含量高的食物;(2)有原發部位腫瘤及其他部位腫瘤者;(3)合并有甲狀腺炎性病變(包括慢性淋巴性甲狀腺炎);(4)無血清樣本。選取同期體檢健康者10例,根據其血清碘含量分為高碘水平組和正常碘水平組,每組研究對象各5例,其中女3例,男7例,年齡(55.2±15.5)歲。兩組間性別(χ2=0.202,P=0.653)、年齡(t=0.878,P=1.597)差異均無統計學意義。本研究獲得山東第一醫科大學倫理評審委員會批準(批準文號:R202211290170),所有受試對象知情同意。

1.2主要儀器及試劑 NanoDrop 2000超微量分光光度計、Invitrogen Qubit 3.0熒光計、ABI 2720 PCR擴增儀、Thermo Varioskan LUX 多功能酶標儀、Total Exosome Isolation(from serum)試劑盒、Trizol(Invitrogen原裝)試劑均購自美國Thermo Fisher Scientific公司,5810R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司),Illumina NovaSeq高通量測序平臺(美國Illumina公司),雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司),芯片分析系統Agilent 2100 Bioanalyzer(美國Agilent公司),HT7700 Exalens日立透射電鏡(日本Hitachi公司),ZetaView納米顆粒跟蹤分析儀(德國Particle Metrix公司),化學發光凝膠成像系統(上海勤翔科學儀器有限公司)。砷鈰催化分光光度法試劑盒(武漢眾生生化技術有限公司),超純RNA提取試劑盒(江蘇康為世紀生物科技有限公司),氯仿、無水乙醇(天津凱通化學試劑有限公司),無RNase水(北京索萊寶公司)。

1.3方法

1.3.1樣本采集 采集各研究對象在清晨空腹條件下(禁食8 h以上)肘前靜脈血5 mL置于真空管內,甲狀腺結節患者于術前采集,體檢健康者于體檢當日采集,室溫下經離心處理分離血清,取上清液并置于-80 ℃凍存。

1.3.2血清碘含量測定 按照雙光束紫外可見分光光度計及砷鈰催化分光光度法試劑盒說明書檢測各組研究對象血清中的碘濃度。將血清碘含量為90 μg/L以上定義為高碘水平,將血清碘含量為45～90 μg/L定義為正常碘水平[6]。

1.3.3血清外泌體的提取 按照Total Exosome Isolation(from serum)試劑盒說明書提取血清中的外泌體。用100 μL PBS重懸外泌體,制成穩定懸液,置于-80 ℃凍存。

1.3.4血清外泌體的鑒定 吸取外泌體樣本10 μL滴加于銅網上沉淀1 min,濾紙吸去浮液。取醋酸雙氧鈾10 μL滴加于銅網上沉淀1 min,濾紙吸去浮液,常溫干燥數分鐘,100 kV進行電鏡檢測成像,獲得透射電鏡成像結果。取凍存樣本,25 ℃水浴解凍,冰上靜置,用1×PBS進行稀釋,樣本直接用于NTA檢測。

1.3.5血清外泌體miRNA的提取及高通量測序 按照超純RNA提取試劑盒說明書提取外泌體中的總RNA,應用芯片分析系統Agilent 2100 Bioanalyzer進行質控,將質檢合格的樣本逆轉錄為cDNA,通過qPCR擴增miRNA并引入特異性標簽。利用高分辨率的聚丙烯酰氨凝膠電泳純化miRNA文庫,確定文庫片段大小分布,評估是否適合上機,合格樣本采用Illumina NovaSeq高通量測序平臺進行高通量測序。

1.3.7差異miRNA靶基因預測及生物信息學分析 使用TargetScan(http://www.targetscan.org/)、miRanda(http://www.microrna.org/)軟件對差異表達miRNA進行靶基因預測。采用R包(4.1.2)clusterProfifiler軟件進行GO和KEGG富集分析,分析基于差異表達分析結果中標記為up down差異miRNA的所有靶基因,通過GO富集分析,按照Cellular component(CC)、Molecular function(MF)、Biological process(BP)對呈顯著差異表達的基因進行分類,揭示樣本差異在基因功能上的體現,通過KEGG富集分析,推斷差異miRNA靶基因所涉及的顯著性富集的分子通路,進而分析其主要參與的生化代謝通路和信號轉導通路。

2 結果

2.1血清外泌體鑒定 使用HT7700 Exalens日立透射電鏡觀察高速離心提取的血清外泌體的形態,發現在深色背景下可見圓形、類圓形且形態完整的雙側膜結構雙凹圓盤狀外泌體,分離的外泌體中無其他細胞成分,見圖1A。納米粒徑分析顯示血清外泌體平均粒徑為103.2 nm,顆粒濃度約為107～1012particles/mL,見圖1B。

2.2樣本測序結果合并后分析的基本情況 4組樣本構建miRNA文庫,得到其原始reads數及經過質控修剪過濾后的clean reads數,與已知miRNA庫中比對上的miRNA數量分別為高碘甲狀腺結節組808個、正常碘甲狀腺結節組688個、高碘健康人組1 090個、正常碘健康人組1 140個。見表1。

表1 各組測序結果合并后的基本資料

2.3各組表達共同與特異的miRNA基本情況 各組共同表達的外泌體miRNA占所有表達量的42.98%,高碘甲狀腺結節組中特異表達的占總表達的2.44%,正常碘甲狀腺結節組占比為2.10%、高碘健康人組占比為8.56%、正常碘健康人組占比為9.01%。見圖2。

表2 高碘組和正常碘組共同差異表達miRNA的比較

圖3 高碘組與正常碘組共同出現差異表達miRNA的Venn圖

2.5靶基因預測及生物信息學分析 使用TargetScan和miRanda軟件對差異表達miRNA進行靶基因預測,總共預測到684個靶基因。對差異表達的6個miRNA的靶標基因進行GO分析,對分析結果按照CC、MF、BP進行分類,結果顯示這些差異表達的miRNA所調控的靶基因大多參與mRNA的剪接調整、細胞分化、B細胞介導的免疫調節等生物過程(圖4)。對共同出現差異表達的6個miRNA目標基因進行KEGG功能注釋分析,結果顯示所預測的靶基因富集于多條與腫瘤關系密切的通路(如MAPK信號通路、PI3K-AKT信號通路、VEGF信號通路及NF-κB信號通路)。見表3。

表3 差異表達miRNA預測的靶基因及其富集通路

圖4 靶基因的GO分析結果

3 討論

本研究通過檢測分析不同碘水平甲狀腺結節患者與健康人之間血清外泌體miRNA的差異表達,發現miR-324-5p、miR-6511b-3p、miR-9903、miR-550a-3p、miR-5001-3p、miR-3688-3p這6個miRNA在甲狀腺結節患者中的表達水平明顯下調,提示上述差異miRNA有望作為甲狀腺結節的潛在生物學標志物。

碘水平的高低不僅僅會影響甲狀腺疾病的發生發展,也會影響miRNA在人體內的表達,例如Wang等[7]的研究發現,高碘會影響miR-422a,導致其表達下調,進而負調控MAPK1的表達,促進甲狀腺腫瘤的生長。還有學者提出,甲狀腺疾病的診斷基礎是基于準確的甲狀腺功能檢測而言的,而在碘缺乏或者碘過量的情況下都會影響甲狀腺功能檢查,進而影響臨床醫師對疾病的判斷[8]?；谶@些研究,筆者有理由懷疑不同碘水平甲狀腺結節患者在進行檢查時所需的外泌體miRNA生物學標志物可能不同,為了簡化外泌體miRNA應用于臨床檢驗時的步驟,本研究分析了6個在不同碘水平下均呈差異表達的miRNA,有望成為無論是高碘患者還是正常碘患者均適用的血清外泌體miRNA生物學標志物。

本研究通過分析差異表達外泌體miRNA參與調控的相關通路,發現miR-324-5p的靶基因主要富集于VEGF信號通路,與本研究發現類似,Yang等[9]發現在發生淋巴結轉移的甲狀腺乳頭狀癌患者中miR-324-5p通過VEGF信號通路誘導HUVEC侵襲/遷移和巨噬細胞M2極化,從而參與了甲狀腺乳頭狀癌的進展。此外,另有研究證實,miR-550a-3p在乳腺癌患者體內表達降低,其進一步通過機制研究發現,miR-550a-3p可以通過抑制Ras/ERK通路中2個關鍵效應因子ERK1和ERK2的表達,從而發揮抑癌作用[10],提示在甲狀腺結節患者中miR-550a-3p可能發揮了同樣的作用,然而,其具體的機制仍需要進一步的實驗加以驗證。

綜上所述,筆者通過分析不同碘水平人群中血清外泌體差異miRNA的共同交集表達,初步篩選出6個可以作為鑒別不同碘水平甲狀腺結節患者和健康人的潛在生物學標志物。然而,本研究存在一定局限性,一是檢測的樣本較少,尚不能明確其臨床診斷效能;二是qRT-PCR的結果也僅能說明所篩的miRNA表達量較高,不存在因為表達量過低而導致血清中無法檢出的情況。因此,未來仍需要進一步擴大樣本量,以證明其潛在的診斷效能及臨床應用價值。