單根納米線電極的制備與表征

鐘琳

（湖北大學 化學化工學院，湖北 武漢 430061）

細胞是生命體的基本結構和功能單元，許多生命活動都發生在單細胞甚至亞細胞水平上。在眾多納米尺度的研究技術中，基于納米電極的電化學方法具有高靈敏度、高時空分辨率和強大的定量能力等優點，已被廣泛應用于單細胞研究領域中。例如，納米電極具有極小的尺寸，在探索亞細胞和細胞生物過程（如細胞內事件和細胞間通訊過程）的同時，能夠很好地維持細胞活力。此外，通過將納米電極與其他平臺（如掃描電化學顯微鏡、原子力顯微鏡和掃描離子電導顯微鏡）進一步結合，還可以實現同時獲取細胞的電化學信號和形貌信息[1-3]。盡管基于納米電極的電化學方法已經取得了巨大的進步，但納米電極的發展仍然遇到一些不可避免的阻礙，如制備過程復雜耗時、技術難度高以及機械穩定性較差等。

銀納米線（Ag NWs）是一種近期發展迅速的一維納米材料，其導電性和機械性能良好，因此可作為基底材料用于制備納米電極[4-5]。目前已有多種合成Ag NWs的方法，包括模板法、微波加熱法、紫外線照射法和多元醇法等。與其他合成方法相比，多元醇法具有工藝簡單、尺寸均勻、分散性好以及結構可控等優點[6-7]。因此，通過控制反應條件或者引入控制性物質（如不銹鋼片、二價或三價鐵鹽、一價或二價銅鹽、硫離子和氯離子等），可以大規模地合成具有不同長徑比的Ag NWs。

本文首先采用多元醇法合成Ag NWs，優化其反應條件，隨后在碳纖維微電極表面靠取單根Ag NW 以制備單根銀納米線電極（Ag NWE），電極制備過程如圖1所示。最后，對制備的Ag NWE 進行形貌、電化學和單細胞插入表征，證明其具有合適的一維尺寸、良好的電化學性能和機械性能，這不僅促進了納米電極的發展，還為單細胞研究提供了一種極具潛力的納米工具。

圖1 銀納米線電極（Ag NWE）制備過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of the preparation process of silver nanowire electrode（Ag NWE）

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

硝酸銀（AgNO3）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP，Mw=1 300 000），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙二醇（EG）、二水合氯化銅（CuCl2·2H2O）、乙醇（C2H6O）、鐵氰化鉀［K3Fe（CN）6］、氯化鉀（KCl），國藥集團化學試劑有限公司；六水合三氯化鐵（FeCl3·6H2O），北京伊諾凱科技有限公司；導電銀膠AS6880，浙江善仁新材料科技有限公司；聚二甲基硅氧烷（PDMS），道康寧有限公司；玻璃毛細管，內徑Φ 0.5 mm，成都華西醫科大學儀器廠；高分化的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12），賽百慷生物技術股份有限公司。

1.2 分析測試儀器

Sigma 500 掃描電子顯微鏡，德國蔡司；MF-830 拋光儀，日本成茂；MP-225 電動微操縱器，美國Sutter；Ti2-U 倒置熒光顯微鏡，日本尼康；CHI 660E 電化學工作站，上海辰華儀器有限公司。

1.3 合成與優化銀納米線

采用改進的多元醇法[8]合成Ag NWs。首先將5 mL 0.05 mol/L AgNO3/EG 溶液和5 mL 0.1 mol/L PVP/EG 溶液加入到聚四氟乙烯內膽中混合，在80℃下邊加熱邊攪拌，然后將10 μL 0.025 mol/L FeCl3溶液加入至上述混合溶液中，在160℃下孵育10 h。最后，用去離子水清洗沉淀物5 次以去除PVP 殘留物，12 000 r/min 離心5 min后將產物分散在乙醇中。

為了探究AgNO3與PVP之間的摩爾比對Ag NWs形貌尺寸的影響，將上述過程中AgNO3和PVP的摩爾比從1∶2 提高至1∶6。同時根據文獻[9]所述，還可以通過改變金屬離子的種類來合成Ag NWs，以探究其對Ag NWs形貌尺寸的影響。合成過程如下：首先，將圓底燒瓶中20 mL 的EG 溶液在160℃的油浴條件下預熱5 min，然后向溶液中添加1.5 mL 8 mmol/L 的CuCl2溶液，10 min后向溶液中加入10 mL 0.12 mol/L的AgNO3和0.36 mol/L PVP的混合物。反應25 min后，沉淀以2 000 r/min的轉速離心5 min，并用丙酮和乙醇洗滌。最后，將Ag NWs分散到乙醇溶液中，備用。

1.4 制備銀納米線電極

Ag NWE 的制備過程如圖1 所示。首先，采用火焰蝕刻的方法[10]制備了長度約為10 ～20 μm、尖端直徑約為1 μm 的碳纖維電極（CFE）。然后，在拋光儀的輔助下，將導電銀膠薄薄地涂覆在暴露的碳纖維上。隨后，將CFE的尖端放入Ag NWs分散液中靠取數次，在拋光儀下觀察是否成功蘸取單根Ag NW，反復蘸取直至成功為止?？咳〕晒螅瑢g NW 與碳纖維的連接處在拋光儀的鉑絲上稍加熱，然后將其置于60℃烘箱中干燥，以加固單根Ag NW 與碳纖維之間的連接。然后將干燥后的電極通過橡皮泥水平固定在拋光儀的橫向玻璃夾上，拋光儀的豎向玻璃夾上豎直放置裝有PDMS的玻璃毛細管（尖端直徑約為2 μm），用硅膠毛細管和注射器將玻璃毛細管中的PDMS壓出掛在毛細管尖端，并將PDMS修飾在碳纖維上以實現絕緣，使電極僅暴露出Ag NW 作為電極活性區域。最后，將其放置于60℃烘箱中干燥即完成電極的制備。

1.5 細胞培養與單細胞插入實驗

PC12 細胞在RPMI-1640 培養基（Gibco，補充10%胎牛血清和2% 100 U/mL 青霉素-鏈霉素混合溶液）中培養，培養箱保持在37℃和5% CO2條件下。當培養瓶中的細胞密度達80%～90%時，按傳代比例為1∶4進行傳代（培養瓶中的細胞一般3～4天傳代一次，每兩天更換一次培養基）。

在進行單細胞插入實驗之前，PC12 細胞在35 mm培養皿中培養2～3 天，并且培養皿中的培養基額外添加了50 ng/mL 的NGF。隨后，用PBS 溶液取代培養基，將準備的細胞培養皿用于單細胞插入實驗。具體過程如下：將Ag NWE 安裝在電動微操縱器上，在倒置熒光顯微鏡的觀察下，通過微操縱器將電極尖端的Ag NW精準地插入到單個PC12細胞內。

2 結果與討論

2.1 銀納米線的表征

在采用多元醇法合成Ag NWs 的過程中，AgNO3和PVP 之間的摩爾比、金屬鹽種類等都會對Ag NWs 的形貌尺寸產生影響。因此，在制備Ag NWE 之前，首先對合成Ag NWs的反應條件進行優化，同時通過倒置熒光顯微鏡對不同摩爾比的AgNO3與PVP 以及不同金屬鹽合成的Ag NWs進行形貌表征。如圖2 a所示，當AgNO3與PVP之間的摩爾比為1∶2，金屬鹽為FeCl3時，Ag NWs的長度較短，大約為15 μm，并且其產率較低。隨后，通過提高PVP 濃度將摩爾比調節至n（AgNO3）∶n（PVP）=1∶6，從圖2 b中可以觀察到，Ag NWs的長度有所增加，但其產率并沒有顯著提高，這可能是因為過量的PVP完全包覆了銀顆粒晶種，導致其無法在一維方向上優勢生長[11]。最終，將AgNO3與PVP之間的摩爾比調節為1∶3，如圖2c 所示，產物以Ag NWs 為主，并且其在分散液中具有較好的分散性。另外，文獻表明Fe3+和Cu2+被EG還原后能有效清除反應體系中的氧，使一維生長的銀顆粒晶種不會因為氧化而溶解，同時Fe3+作用要強于Cu2+，但還原后的金屬離子可能會占據銀顆粒晶種上的高能量位點缺陷，從而導致溶液中Ag 原子無法在這些高能量位點缺陷上聚集和生長[12]，所以在合成Ag NWs 時選擇CuCl2作為金屬鹽。

圖2 不同反應條件下合成的Ag NWs 在倒置熒光顯微鏡下的圖像Fig.2 Images of Ag NWs synthesized under different reaction conditions under inverted fluorescence microscopy

掃描電鏡分析表征Ag NWs 的形貌見圖3，Ag NWs的長約30 μm，直徑約Φ200 nm，前后均一。結果證明，通過優化反應條件成功制備了符合形貌要求的Ag NWs。

圖3 Ag NWs（對應于圖2 c）的掃描電鏡圖像及其放大圖像Fig.3 SEM images of Ag NWs（corresponding to Fig.2c）and their enlarged images

2.2 銀納米線電極的表征

采用簡單的靠取法制備了以CFE 為基底的Ag NWE，從圖4 a 可以看出，Ag NW 與碳纖維連接良好，并且暴露于尖端的工作段Ag NW 呈筆直狀且直徑均一，其長度為20 μm 左右，這確保了電極在細胞內檢測時有足夠的插入深度，符合納米電極應具備的尺寸要求。為了進一步從功能上驗證制備的Ag NWE 是否成功電連接，通過循環伏安法對其進行了電化學性能表征。將制備的CFE 和Ag NWE 分別置于含有1 mmol/L K3Fe（CN）6的1 mol/L KCl溶液中進行循環伏安法測試，如圖4 b 所示，CFE 和Ag NWE 的循環伏安都呈“S”型，符合超微電極的循環伏安特征。但與CFE 相比，Ag NWE 的循環伏安曲線具有明顯的氧化還原峰，表明其電流信號較強，進一步證明Ag NW 與CFE 之間形成了緊密的電連接，表明制備的Ag NWE 具有良好的導電性。

圖4 Ag NWE的掃描電鏡圖像及其在含有1 mmol/L K3Fe（CN）6的1 mol/L KCl溶液中的循環伏安圖Fig.4 SEM image of Ag NWE and its cyclic voltammetry in 1 mol/L KCl solution containing 1 mmol/L K3Fe（CN）6

此外，為了將制備的Ag NWE 應用于細胞內檢測，其應具有良好的機械性能，以減少操作中的損毀。如圖5 所示，制備的Ag NWE 在插入單個PC12 細胞時，Ag NW 并沒有出現折斷或彎曲的現象，而細胞在電極插入過程中發生輕微變形，并且可以從培養皿底部被電極抬起，直觀地證明了所制備電極的機械性能優異，可以滿足在細胞內檢測的操作中對電極機械性能的要求。

圖5 Ag NWE在插入單個PC12細胞過程中不同階段的明場圖像（比例尺為50 μm）Fig.5 Brightfield images of Ag NWE at different stages during insertion into single PC12 cell（Scale = 50 μm）

3 結論

本研究首先通過改變PVP與AgNO3之間的摩爾比、金屬鹽的種類，合成了長度為30 μm 左右、直徑約為200 nm 的Ag NWs，然后采用靠取法成功制備了以CFE為基底的Ag NWE。電極經過一系列表征后，結果證明，其具有合適的尺寸、優異的導電性和良好的機械穩定性，可以滿足在細胞內檢測的實際需求。后續將尋找合適的活性材料和電極修飾方式，以構建高性能的單細胞納米工具。