乳及乳制品中嗜冷菌多樣性的研究進展

孫苗，邵偉，劉政宇，馬憲蘭，陳賀，趙艷坤,3

1.新疆農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室，新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實驗室（烏魯木齊 830091）；2.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)實驗室（烏魯木齊 8300522）；3.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶及奶制品質(zhì)量安全控制重點實驗室（北京 100193）

嗜冷菌是危害乳品質(zhì)的主要腐敗菌群之一，在原料乳的運輸儲藏期間嗜冷菌大量繁殖，并產(chǎn)生耐高溫的腐敗酶，這些腐敗酶會水解乳中的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，導致成品乳出現(xiàn)結(jié)塊、變味、凝乳等現(xiàn)象。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)原料乳中常見的嗜冷菌有假單胞菌屬、不動桿菌屬、氣單胞菌屬、沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬、乳球菌屬和微桿菌屬等[1-2]。大多數(shù)嗜冷菌可以在加工設(shè)備上形成生物膜，這些生物膜就充當了微生物的“潛在滋生地”，由于嗜冷菌具有生物轉(zhuǎn)移潛力，會利用生物膜這種天然介質(zhì)進入乳中，這種方式就成為了嗜冷菌的持久污染源。

近年來，針對乳及乳制品中微生物污染的研究主要集中在細菌的多樣性、致病菌的監(jiān)測控制及腐敗菌的快速檢測方面，目前國內(nèi)外關(guān)于嗜冷菌多樣性的研究熱點也在持續(xù)增加。Hantsis-Zacharov等[3]研究了4個農(nóng)場原料乳中可培養(yǎng)嗜冷菌的多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)春季和冬季的優(yōu)勢菌為γ-變形菌綱，夏季優(yōu)勢菌為桿菌綱，秋季優(yōu)勢菌為放線菌綱。

嗜冷菌危害一直是制約我國乳制品發(fā)展的一大隱患，為了更全面地評估乳中嗜冷菌的污染狀況，文章通過對比分析國內(nèi)外現(xiàn)有檢測技術(shù)，探究乳及乳制品中嗜冷菌的組成及多樣性分布，有助于判定乳及乳制品中潛在的嗜冷菌污染風險，提高乳制品品質(zhì)、保護消費者的健康。

1 乳及乳制品中嗜冷菌多樣性國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

長期以來，國內(nèi)外學者不斷在低溫環(huán)境中分離出大量嗜冷菌，在基礎(chǔ)理論研究方面較深入，而對乳及乳制品中的嗜冷菌群落組成及多樣性的研究與分析方面還有廣闊的研究前景。隨著現(xiàn)代生物檢測技術(shù)日新月異，研究人員也通過這些迭代更新的檢測技術(shù)在乳品中發(fā)現(xiàn)了更多潛在的嗜冷菌新種屬，其危害機制也日漸清晰。

1.1 國內(nèi)對嗜冷菌多樣性的研究現(xiàn)狀

嗜冷菌是危害乳品質(zhì)的主要腐敗菌群之一，嗜冷菌污染發(fā)生在乳制品生產(chǎn)的各個階段，以往研究也已證實其多樣性易受到地域、氣候及儲藏條件等多種因素影響。國內(nèi)研究人員通過基因測序等技術(shù)的分型鑒定，在牛乳中發(fā)現(xiàn)了大量細菌種群，如原料乳中常見的嗜冷菌分布在9個菌綱中，其中γ變形菌綱、芽孢桿菌綱和放線菌綱的富集度最高，每個菌綱會出現(xiàn)18～21個菌種，它們主要分布于變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門4個菌門。原料乳的質(zhì)量決定了乳制品的安全與品質(zhì)，冷藏時的原料乳也是嗜冷菌的最佳安居之所。杜兵耀[4]對重慶原料乳樣品中的嗜冷菌進行分離鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氣單胞菌屬、鏈球菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、不動桿菌屬是乳中的優(yōu)勢嗜冷菌屬。而屠大偉等[5]在重慶另一牧場的原料乳中鑒定出的優(yōu)勢嗜冷菌屬為不動桿菌屬、芽孢桿菌屬和克雷伯氏菌屬。不難發(fā)現(xiàn)即使是同一地區(qū)的原料乳，乳中嗜冷菌主要屬的相對豐度卻不相同，推斷這些差異是由于不同牧場的飼養(yǎng)管理環(huán)境，如土壤、飼料、擠奶和養(yǎng)殖設(shè)備造成的。也有研究反映出同一動物的不同品種所產(chǎn)動物乳中的嗜冷菌結(jié)構(gòu)也存在差異，例如：馬靜等[6]對青海地區(qū)的牦牛乳微生物進行分離鑒定，結(jié)果顯示青海牦牛乳中優(yōu)勢菌門為厚壁菌門和變形菌門，從屬水平來看，優(yōu)勢菌屬為不動桿菌屬和乳桿菌屬；閆艷華等[7]分析了奶牛養(yǎng)殖場4個關(guān)鍵采奶環(huán)節(jié)對原料乳細菌多樣性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同采奶環(huán)節(jié)奶中細菌種群結(jié)構(gòu)多樣性與豐富度差異較大，其中采奶罩杯中的細菌豐度最高，而儲奶罐奶中OTU（operational taxonomic unit，OTU）數(shù)目最少但嗜冷菌占比最多，可能是由于原料乳在經(jīng)過低溫管道流入儲奶罐的過程中其他微生物在低溫條件下生長受到抑制，而適應低溫環(huán)境的嗜冷菌大量繁殖。可見，乳中嗜冷菌的水平和多樣性與自然環(huán)境、擠奶方法和擠奶設(shè)備等整體衛(wèi)生狀況都密切相關(guān)。

自19世紀50年代低溫保存技術(shù)的出現(xiàn)，低溫保存成為了抑制乳中微生物污染的一個重要環(huán)節(jié)。嗜冷菌占初始生乳微生物群的不到10%，而采集的原料乳在投入生產(chǎn)前往往需要4 ℃冷藏一段時間，冷藏過程中嗜冷菌就在微生物群落中占據(jù)了主導地位，乳中的嗜冷微生物會產(chǎn)生細胞自身的一些改變和一系列冷應激蛋白的翻譯表達，例如利用不飽和脂肪酸、抗凍蛋白、冷休克蛋白以及冷活性酶的產(chǎn)生幫助其實現(xiàn)在低溫條件下生長繁殖，保持細菌的生命力[8-10]。經(jīng)過這些適應過程，嗜冷菌形成了生物膜和群體感應，使其存活率和耐受性明顯提升。但是由于每種嗜冷菌在低溫環(huán)境下的生長特性不同，即使在恒定低溫條件下，不同季節(jié)或不同地域嗜冷菌的菌群結(jié)構(gòu)也大不相同[10]，研究發(fā)現(xiàn)隨著冷藏時間的推移，嗜冷菌總數(shù)在72 h內(nèi)可以增加62%左右，冷藏72 h內(nèi)菌屬的豐度由不動桿菌屬、鏈球菌屬、無漿體屬和梭菌屬向黃桿菌屬、假單胞菌屬和乳球菌屬逐漸變化[11]。而王媛媛等[12]的研究結(jié)果顯示在4 ℃冷藏72 h內(nèi)不動桿菌屬始終是優(yōu)勢菌屬，乳球菌屬、黃桿菌屬和假單胞菌屬的占比一直有所增加。整個冷藏過程是一個微生物與乳環(huán)境之間動態(tài)交互的過程，即使是同一種菌體在不同環(huán)境因素的影響下，其所表達的蛋白質(zhì)也可能有所不同，最終導致其產(chǎn)蛋白酶的能力也不盡相同。卞永霞等[13]通過質(zhì)譜法從分子水平上對原料乳4 ℃冷藏6 d期間的微生物菌體蛋白質(zhì)進行相對定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在整個冷藏過程中相對豐度較高的蛋白質(zhì)主要來源于假單胞菌屬、梭菌屬、黃桿菌屬和環(huán)絲菌屬。假單胞菌屬所產(chǎn)蛋白質(zhì)的相對豐度在整個過程中始終占據(jù)主要地位（38.39%～42.41%），且在低溫儲存4 d時達到最高。先前的研究均顯示出嗜冷菌群落是一個復雜多變的體系，其中嗜冷菌的多樣性取決于動物的泌乳期、儲存時間、環(huán)境、季節(jié)以及初始微生物群落，不同原料乳的嗜冷菌群落結(jié)構(gòu)的變化趨勢以及對乳品質(zhì)的危害程度在各種因素的影響下也不完全一致。

1.2 國外對嗜冷菌多樣性的研究現(xiàn)狀

乳及乳制品中的微生物群是復雜多樣的，其中的微生物多樣性及其相互作用已成為研究者關(guān)注的焦點。目前國外對動物乳中嗜冷菌的研究主要集中在牛奶加工過程中微生物組成的變化及其對牛奶質(zhì)量、風味和產(chǎn)品保質(zhì)期的影響。然而，這些研究大多是針對牛乳進行的，對其他動物乳中嗜冷菌多樣性的研究有限。基于嗜冷菌生物膜形成能力的多樣性以及營養(yǎng)利用能力的種間差異，導致其在不同乳源中產(chǎn)生了不同生長優(yōu)勢的細菌屬。嗜冷菌在不同乳源中分離得到的常見菌屬如表1所示。

表1 不同乳源中的主要嗜冷菌屬

嗜冷菌的多樣性不僅與動物源有關(guān)，還與生態(tài)環(huán)境中溫度和濕度等密切相關(guān)，這些因素對嗜冷菌的水平及多樣性有重要影響。有研究表明秋季與冬季收集的乳及乳制品中嗜冷菌數(shù)量明顯高于夏季，且其數(shù)量介于102～107CFU/mL之間[18-19]。不同的嗜冷菌屬具有不同的最適生長溫度，這就導致不同季節(jié)具有不同的優(yōu)勢嗜冷菌屬。Li等[20]的研究結(jié)果顯示，假單胞菌、丙酸桿菌和黃桿菌的相對豐度較高與低溫相關(guān)，例如假單胞菌在4至10月平均為12.0%（平均溫度為22.8℃），在11至次年3月平均為32.4%（平均溫度為8.8℃）；不動桿菌在6至9月平均為19.4%（平均溫度為25.7 ℃），在10至次年5月平均為6.0%（平均溫度為12.6 ℃），這與Vithanage等[21]的研究結(jié)果一致。以上研究都揭示出嗜冷菌的組成結(jié)構(gòu)在一年內(nèi)的不同季節(jié)具有高度的多樣性，說明環(huán)境因素在塑造乳及乳制品嗜冷菌群的組成中起著至關(guān)重要的作用。

2 乳及乳制品中嗜冷菌檢測方法

2.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)法

傳統(tǒng)培養(yǎng)法是采用平板牛奶計數(shù)瓊脂和規(guī)定數(shù)量的樣品，制備傾注平板，并在有氧條件下將平板置于6.5 ℃培養(yǎng)10 d，最終通過觀察瓊脂平板上獲得的菌落數(shù)和稀釋水平來計算每毫升樣品中菌落形成單位。

傳統(tǒng)的嗜冷菌培養(yǎng)方法一直是研究乳及乳制品中嗜冷菌菌群結(jié)構(gòu)的“金標準”。由于嗜冷菌生長在特定的環(huán)境溫度下，通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法能夠準確定位嗜冷菌在原料乳菌群中的群落組成，進而再采用分子生物學鑒定手段可鑒定出大多數(shù)嗜冷菌分離株至種的分類學水平，從而確定乳中的嗜冷菌種類、水平及其相關(guān)生物學信息。這種方法能準確評價乳中嗜冷菌分布水平并得到嗜冷菌菌落的準確計數(shù)結(jié)果，通過對嗜冷菌株的分離純化還可以得到單一菌株，為嗜冷菌的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)，包括嗜冷菌的代謝產(chǎn)物及其所產(chǎn)腐敗酶的耐熱性等，該方法最終可為探究嗜冷菌對乳制品品質(zhì)的不良影響及其快速檢測方法的建立提供理論基礎(chǔ)[22]。

但是，這種傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法也存在一部分弊端。一方面，嗜冷菌需要在特定的低溫條件下培養(yǎng)7～10 d，這就導致從培養(yǎng)到鑒定的時間間隔過長，現(xiàn)有研究證明檢測間隔時間的長短會影響乳中嗜冷菌最終的檢測結(jié)果，樣品檢測間隔時間越久，最終檢測結(jié)果往往不具有準確性和說服性。另一方面，傳統(tǒng)培養(yǎng)法僅僅能夠?qū)κ壤渚M行分類學地位鑒定，但無法準確測定嗜冷菌在乳品中菌群的相對豐度及多樣性分布。

2.2 現(xiàn)代分子生物學方法

近年來，以核酸和蛋白質(zhì)等物質(zhì)為檢測目標的分子生物學技術(shù)蓬勃發(fā)展，已被廣泛應用于食品微生物檢測的各個領(lǐng)域，主要的檢測方法有聚合酶鏈反應檢測技術(shù)（Polymerase Chain Reaction，PCR）、酶聯(lián)免疫、數(shù)字環(huán)介導等溫擴增和熒光原位雜交等技術(shù)，這些技術(shù)在檢測乳及乳制品中微生物時都具有各自的特點[23]，乳及乳制品中嗜冷菌快速檢測方法如表2所示。這些方法可以實現(xiàn)對一些難以培養(yǎng)和不可培養(yǎng)微生物的監(jiān)測，并能獲得微生物群落分布結(jié)構(gòu)及相對豐度信息。綜合上述，考慮選用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和分子生物學技術(shù)相結(jié)合的方式能夠更加全面、準確地描述乳中嗜冷菌群落的相關(guān)信息。

表2 乳及乳制品中嗜冷菌快速檢測方法

2.3 單分子實時測序

目前實時熒光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR）、酶聯(lián)免疫技術(shù)、數(shù)字環(huán)介導等溫擴增技術(shù)和熒光原位雜交等分子生物學技術(shù)被廣泛應用于鑒定細菌分子，這些方法也經(jīng)常用于乳制品中嗜冷菌污染的鑒定以及嗜冷菌群落結(jié)構(gòu)的研究。然而，它們僅限于檢測特定的目標分類群，不能完整地描述整體的樣本微生物概況，并存在檢測時間長和不利于群落相關(guān)性研究等局限性。高通量測序技術(shù)作為新一代分子生物學技術(shù)，被廣泛應用于環(huán)境微生物和食品微生物群落多樣性研究中。高通量測序技術(shù)又稱下一代測序，它的誕生對基因組學研究領(lǐng)域具有里程碑意義，其主要分析過程為：提取樣品總基因組DNA，再對目標片段進行PCR擴增，構(gòu)建測序文庫后上機進行高通量測序，最終對得到的數(shù)據(jù)進行處理并分析微生物群落組成及相關(guān)生物學信息[32]。表3為三代主要測序技術(shù)的技術(shù)核心及技術(shù)特點比較[33-35]。

3 結(jié)語與展望

嗜冷菌污染已然成為現(xiàn)代乳品加工過程中迫切需要解決的問題，也是制約中國乳制品行業(yè)發(fā)展的重要因素。乳制品生產(chǎn)中通常用巴氏殺菌和超高溫滅菌技術(shù)來滅活牛奶中的嗜冷菌，但其產(chǎn)生的熱穩(wěn)定性酶仍具有活性，這些酶會進一步影響乳及乳制品的品質(zhì)及食用安全性。對此，除了要重視對原料乳生產(chǎn)環(huán)境的規(guī)范管理，還要加強在乳品加工過程中原料奶的低溫貯存和制冷運輸技術(shù)，以更好地控制乳與乳制品中嗜冷菌的繁殖。

正因如此，建立準確、便捷的嗜冷菌檢測方法是有效制定嗜冷菌污染解決措旋的必要基礎(chǔ)。目前現(xiàn)有的快速檢測方法在具有優(yōu)勢的同時也都存在著一定的劣勢，還需要進一步改善。完善、重構(gòu)嗜冷菌控制軟環(huán)境體系以降低嗜冷菌污染是未來乳品安全研究的重要方向，更是乳制品全產(chǎn)業(yè)鏈品質(zhì)保障的有力支撐。