夾脊電針通過抑制Xc-/GPX4通路促進脊髓損傷大鼠后肢運動功能恢復

欒逸先,尹洪娜,朱薈一,田洪昭,張文釗,應雨校,李禹洋,李 全△

1.海南省中醫院,海南 海口 570100;2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院,黑龍江 哈爾濱 150001;3.海口市瓊山區云龍鎮衛生院,海南 海口 570100;4.黑龍江中醫藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040

脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)作為常見的、嚴重的中樞神經系統損傷,多造成受損脊髓節段以下所支配部位運動功能和感覺功能障礙,對患者的日常生活造成嚴重影響,對患者及家庭、社會產生極大負擔[1]。SCI分為原發性損傷與繼發性損傷,原發性損傷后,脊髓微環境失衡,大量神經元死亡,產生繼發性損傷[2]。研究證實,中樞神經系統創傷后導致的細胞死亡是神經功能喪失的主要原因,干預細胞死亡可以有效地減輕繼發性損傷,促進SCI恢復[3]。在SCI中發現的細胞程序性死亡主要有凋亡、自噬、焦亡、壞死性凋亡和鐵死亡。其中,鐵死亡(Ferroptosis)是一種重要的細胞死亡方式,是一種鐵離子依賴的脂質過氧化損傷引起的非凋亡程序性死亡途徑[4]。隨著對鐵死亡認識的加深,其在中樞神經系統退行性變與創傷性損傷中的重要作用也被逐漸發現[5]。研究表明,SCI急性期局部出血導致損傷區域鐵離子含量迅速升高,增加活性氧與4-羥基壬烯酸積聚,過量的鐵離子聚集引發鐵死亡發生[6-7]。鐵死亡是繼發性SCI神經細胞死亡的主要機制,可以通過調控Xc-/GPX4通路抑制鐵死亡Xc-/谷胱甘肽過氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)通路促進SCI的修復[8]。鐵死亡受 GPX4-GSH-半胱氨酸軸調節,主要通過系統Xc-攝取胱氨酸,減少GPX4將磷脂氫過氧化物加工成脂醇、GSH合成以及減少胱氨酸向半胱氨酸的轉化[8]。臨床試驗中已證實夾脊電針治療SCI有顯著療效,對SCI后神經系統組織功能恢復具有明顯作用[9]。研究表明,夾脊電針可以減輕脊髓損傷大鼠脊髓神經元細胞中脂質過氧化,修復受損脊髓組織[10]。鐵死亡在SCI中起到重要作用[11],那么夾脊電針能否通過調控Xc-/GPX4通路減少ROS過載從而抑制鐵死亡修復SCI值得進一步探討。

因此,本研究主要觀察夾脊電針對脊髓損傷大鼠后肢運動功能恢復,檢測夾脊電針對鐵死亡關鍵因子GSH、GPX4表達,明確夾脊電針對鐵死亡通路的影響,為臨床運用針灸治療脊髓損傷提供新的思路和分子生物學理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

72只健康清潔級雄性Sprague Dawley大鼠由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供,體質量220～250 g,于黑龍江中醫藥大學針灸臨床神經生物學重點實驗室動物房進行分籠飼養,每籠4只,室溫(20±2)℃,相對濕度25%～75%,12 h光照/黑暗循環,自由進食飲水,每日更換墊料,適應性喂養7 d。動物使用和護理規程符合國家衛生研究院制定的《實驗動物使用和護理指南》。實驗經海南省中醫院實驗動物管理與使用委員會審批(批號:IACUC-HPHCM-231200)。

1.2 試劑及儀器

1.2.1 試劑 GPX4 RabbitPolyClonal antibody (美國proteintech);beta-Actin Mouse MonoClonal antibody(美國proteintech);HRP-Goat-Anti-Rabbit IgG(H+L)(美國proteintech);HRP-Goat-Anti-Mouse IgG(H+L) (美國proteintech);GSH檢測試劑盒(中國索萊寶);甲苯胺藍(中國Biosharp);伊紅染色液(中國Biotopped);Harris染色液(中國Biotopped)。

1.2.2 儀器 Impactor M-Ⅲ型脊髓打擊器(美國NYU);Micro Plus型脈沖電針儀(美國);0.30 mm×13 mm無菌針灸針(吳江市云龍醫療器械有限公司);Centrifuge 5418高速離心機(德國eppendorf);Primo Star普通光學顯微鏡(德國ZEISS);NanoQuant infinite M200PRO多功能酶標儀(瑞士TECAN);Centrifuge 5418高速離心機(德國eppendorf);miniPRO4迷你垂直電泳儀(北京WIX);ChemiDoc MP化學發光成像系統(美國BIO-RAD);HZQ-F100振蕩培養箱(北京海天友誠科技有限公司);ChemiDoc MP化學發光成像系統(美國BIO-RAD)。

1.3 動物分組

72只大鼠隨機分為假手術組(Sham)、模型組(SCI)、夾脊電針組(EA)和抑制劑(Fer-1)4組,每組18只,再將每組按照不同的治療時間分為3 d組、7 d組與14 d組3個亞組,每亞組6只。

1.4 模型制備

使用ALLEN’s方法制備脊髓損傷大鼠模型[12]:大鼠于手術前10 h禁食禁水,10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.03 mL/10 g),俯臥位固定軀干及四肢。手術局部脫毛備皮,進行規范消毒處理后加鋪無菌手術巾。以第10胸椎(T10)節段為中心(背部棘突手觸及圓鈍點處)沿脊柱后正中線做縱向切口,鈍性剝離肌肉,切除T10椎板,充分暴露T10對應脊髓。使用NYU Impactor M-Ⅲ打擊器進行脊髓損傷:一根重10 g(底部直徑2.5 mm)的沖擊棒,落差為50 mm,損傷能量為50 g·cm,造成相對嚴重損傷。其造模成功的標志為:當打擊棒接觸到脊髓時,與探針形成閉合回路提示音,打擊后可見損傷節段脊髓立即出現血腫,大鼠出現左右甩尾現象伴雙下肢的抽搐,隨后鼠尾完全下垂,無自主運動。同時軟件提示無錯誤,電腦記錄撞擊過程呈拋物線。打擊成功后在損傷節段外側皮膚進行標記,以備針刺干預,生理鹽水清洗并在縫合處使用抗生素(阿莫西林)預防感染[13]。術后每只鼠單獨飼養,保溫至大鼠蘇醒。每天輔助排尿,早晚各1次直至排尿功能恢復,按摩大鼠腹部,防止胃脹氣和排便困難。

假手術組大鼠僅進行椎板切除,不進行脊髓打擊。

1.5 干預方法

電針組(EA):損傷后進行夾脊電針治療[14],操作方法:選取損傷區(造模標記處)上、下棘突節段旁開7 mm(豎脊肌處)以內處,左右分別取穴。常規消毒后用毫針刺入,針尖指向脊柱,使針尖觸及椎板。針刺成功后使用Micro Plus型脈沖電針儀,正極連接上端針柄,負極連接同側下端針柄,雙側相同處理。電針選取參數:①脈沖波型:連續脈沖波形;②脈沖重復頻率:100 Hz;③電流輸出強度:以背部肌肉出現輕微抽動為度(約1 mA)。持續30 min,1次/d。

抑制劑組(Fer-1):損傷后進行藥物干預[15],將抑制劑鐵抑素-1(Fer-1)溶于DMSO溶液配成濃度1 mmol/L,再用生理鹽水稀釋1 000倍制成抑制劑注射液,該配比后抑制劑按大鼠體質量克數×0.001進行腹腔注射。

假手術組與模型組進行同樣方法固定,30 min/次,1次/d,無治療干預。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評分 對脊髓損傷大鼠的后肢功能恢復情況進行評價[16]。量表評分范圍從0分(完全癱瘓)到21分(正常),用于評估關節運動、步態和后肢的協調以及腳趾的精細運動,分數越高代表運動功能越好。各組大鼠按照脊髓損傷3 d、7 d和14 d進行動態評估,將大鼠放于開放視野場地自由移動5 min,由兩名不清楚大鼠分組的研究人員采用盲法進行評分,取平均值進行計算。

1.6.2 斜板實驗 手術前及干預3 d、7 d和14 d對各組大鼠進行斜板測試,將大鼠置于斜道上記錄大鼠能夠停留5 s的最大角度,每只大鼠測量3次取平均值[17]。

1.6.3 HE染色 觀察脊髓病理變化。取制備好的石蠟依次進行切片、脫蠟和水化,蘇木溶液浸泡10 min,流水沖洗1 min,氨水反藍,伊紅染色1 min,蒸餾水漂洗、酒精逐級脫水(85%乙醇-1 s、95%乙醇-3 s、100%乙醇-1 min和100%乙醇-1 min)、二甲苯透明化、中性樹脂封片和鏡檢,于光學顯微鏡(200×)拍照,觀察脊髓病理變化與細胞[18]。

1.6.4 Nissl染色 觀察脊髓前角運動神經元數量。取已制備好的1/3石蠟切片進行脫蠟、水化,置于60 ℃溫箱中1%甲苯胺藍溶液(儲備液:0.5 g甲苯胺藍+100 mL無水乙醇;工作液:50 mL儲備液+50 mL生理鹽水)染色1 h,氯水及95%乙醇分化后脫水、透明和中性樹脂封片。于光學顯微鏡(200×)拍照,觀察染色效果并進行細胞計數[18]。

1.6.5 Western blot檢測 檢測損傷脊髓組織中GPX4蛋白的表達[19]:造模后3 d、7 d與14 d,大鼠用10%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉處死。在冰袋上迅速取下損傷脊髓(距損傷中心1 cm),生理鹽水沖洗后放入標記好的凍存管中,放進-80 °冰箱中待用。檢測時稱量、裂解、勻漿與離心后提取總蛋白處理樣品。利用酶標儀使用BCA法測得蛋白濃度,煮沸冷卻后留出一半樣本應用ELISA檢測,其他樣本加入上樣緩沖液稀釋使各樣品濃度相同,制得蛋白樣品;SDS-PAGE凝膠(根據目的蛋白的分子量選取10%和15%的分離膠,5%的濃縮膠)電泳后轉膜至PVDF膜,1%PBST漂洗2×5 min后5%奶粉室溫封閉1 h;分別加入蛋白抗體:GPX4(稀釋比例1∶5 000)后4 ℃過夜;復溫30 min后1%PBST漂洗3×10 min,加入羊抗兔IgG-HRP(稀釋比例1∶5 000),二抗37 ℃孵育45 min;1%PBST漂洗3×10 min后暗室滴加ECL發光液,使用IMAGE STUDIO成像系統選擇自動曝光時間后采集圖像;應用Image Lab 5.2.1軟件分析條帶灰度值,以蛋白的灰度值/內參(β-Actin)的灰度值為相對表達量[19]。

1.6.6 ELISA檢測 將蛋白樣品按照質量體積比=1∶1加入1倍已配置好的PBS液,勻漿后轉移至離心管中,加入9倍PBS液,震蕩,5 000 r/min離心10 min,取液。按照ELISA試劑盒說明書操作后,使用酶標儀選擇450 nm波長測量各孔吸光度,根據樣品吸光度確定大鼠脊髓組織GSH的表達含量[19]。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠BBB評分比較

各組大鼠BBB評分,SCI后3 d、7 d和14 d,SCI組BBB評分與Sham組比較明顯降低(P<0.01);EA組、Fer-1組BBB評分與SCI組比較明顯增加(P<0.01);EA組BBB評分與Fer-1組比較,在3 d、7 d差異無統計學意義(P>0.05),在14 d有顯著增加(P<0.05)。夾脊電針與抑制劑均能改善SCI后大鼠后肢運動功能,14 d后,夾脊電針的療效優于抑制劑。見表1。

表1 各組大鼠BBB評分

2.2 各組大鼠斜板實驗比較

各組大鼠斜板角度,術前比較差異無統計學意義(P>0.05)。SCI后3 d、7 d與14 d,SCI組斜板角度與Sham組比較明顯降低(P<0.01);EA組、Fer-1組斜板角度與SCI組比較明顯增加(P<0.01);EA組斜板角度與Fer-1組比較,在3 d、7 d差異無統計學意義(P>0.05),在14 d差異有統計學意義(P<0.05)。夾脊電針與抑制劑均能改善SCI后大鼠后肢功能,14 d后,夾脊電針的療效優于抑制劑。見表2。

表2 各組大鼠斜板測試

2.3 各組大鼠脊髓損傷部位病理形態學及前角運動神經元數目的比較

2.3.1 HE染色結果 HE染色觀察各組大鼠脊髓組織病理形態學變化,Sham組脊髓組織結構完整清晰,灰質與白質界限清晰,神經纖維排列規整,神經細胞形態正常且分布均勻,細胞基質較均勻有少許的紅細胞。而SCI組、EA組和Fer-1組脊髓組織結構紊亂,排列松散,神經元死亡。脊髓損傷3 d時間點SCI組具有明顯的病理學改變,灰質結構紊亂,與白質界限不清,神經元大量丟失,剩余神經元腫脹嚴重,大量炎性細胞浸潤(以中性粒細胞與單核細胞為主),明顯的片狀出血灶,而EA組、Fer-1組相對SCI組比較神經元丟失較少。脊髓損傷7 d、14 d時間點SCI組灰質神經元丟失仍然明顯。出血性病灶相對3 d減少,而EA組、Fer-1組灰質結構較完整,神經纖維排列較規整,神經元數量較多,空洞較少,炎性細胞浸潤得到改善。見圖1。

圖1 各組大鼠脊髓組織HE染色(200×)

2.3.2 Nissl染色結果 各組大鼠前角運動神經元,Sham組前角運動神經元排列規整,無明顯減少,細胞呈深藍染色;SCI組、EA和Fer-1組前角運動神經元數量明顯減少,染色相對較淺。在3 d、7 d和14 d時間點,SCI組與Sham組前角運動神經元數量比較,差異均有統計學意義(P<0.01)。SCI后3 d時間點,SCI組前角運動神經元殘存數量顯著減少,而EA組、Fer-1組前角運動神經元殘存數量雖然減少,但相對于SCI組較多,染色相對較深,兩組比較有統計學意義(P<0.01);EA組與Fer-1組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。SCI后7 d 時間點,SCI組前角運動神經元殘存數量顯著減少,而EA組、Fer-1組前角運動神經元殘存數量雖然減少,但相對于SCI組較多,染色相對較深,兩組比較有統計學意義(P<0.01);EA組與Fer-1組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。SCI后14 d時間點,SCI組前角運動神經元殘存數量顯著減少,而EA組、Fer-1組前角運動神經元殘存數量雖然減少,但相對于SCI組較多,染色相對較深,兩組比較差異有統計學意義(P<0.01);EA組與Fer-1組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表3、圖2。

圖2 各組大鼠脊髓前角運動神經元殘存比較(200×)

表3 各組大鼠前角運動神經元數量

2.4 各組大鼠脊髓組織中GPX4蛋白表達量比較

各組大鼠GPX4表達量,SCI后3 d、7 d與14 d,SCI組GPX4的表達與Sham組比較明顯降低(P<0.01);EA組、Fer-1組GPX4的表達與SCI組比較明顯增加(P<0.01);EA組3 d與SCI組間比較差異無統計學意義(P>0.05);EA組GPX4的表達與Fer-1組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4、圖3。

圖3 各組大鼠脊髓組織中GPX4蛋白表達量比較

表4 各組大鼠GPX4表達量

2.5 各組大鼠脊髓組織中GSH水平比較

各組大鼠GSH表達量,SCI后3 d、7 d與14 d,SCI組與Sham組比較明顯降低(P<0.01);EA組、Fer-1組GSH的表達與SCI組比較明顯增加(P<0.01);EA組GSH的表達與Fer-1組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 各組大鼠GSH表達量

3 討論

越來越多的證據表明夾脊電針能夠有效促進脊髓損傷修復[19-21]。夾脊電針通過在脊髓損傷部位施加電刺激來促進神經再生和功能恢復。研究表明,夾脊電針可以改善脊髓損傷患者的運動功能、感覺功能和自主神經功能[22]。夾脊電針源于中醫古籍中的“夾脊療法”,被認為具有疏通經絡、活血化瘀和統一陰陽等作用[22]。《針灸大成》中記載,夾脊電針能夠刺激脊髓損傷部位的經絡和穴位,從而恢復氣血運行、激發脊髓自愈能力[23]。現代研究發現,在脊髓損傷中,夾脊電針通過多方面發揮作用。電針通過對脊髓損傷區域施加適當的電刺激,可以改善神經細胞的興奮性,促進神經再生和修復[24]。夾脊電針可以促使神經細胞產生和釋放神經營養因子,如腦源性神經營養因子(BDNF)和神經生長因子(NGF),這些因子對于神經再生和功能恢復具有重要作用[25]。夾脊電針可以調節炎癥反應,減輕脊髓損傷部位的炎癥反應,促進組織修復和再生[26]。

本研究結果表明,脊髓損傷后,大鼠后肢運動功能嚴重受損,受損區域脊髓組織中神經組織受損嚴重,GSH水平及GPX4表達均減少。經夾脊電針治療后,大鼠后肢運動功能明顯改善,脊髓受損區域GSH水平及GPX4表達量升高,與鐵死亡通路抑制劑Fer-1所產生的效果一致,說明夾脊電針具有通過抑制鐵死亡的發生減少神經元細胞受損、阻止神經纖維脫髓鞘發生、促進神經細胞恢復和促進大鼠運動功能恢復的作用。

脊髓損傷后,局部區域即刻發生充血腫脹,繼而出現氧化應激、炎癥細胞浸潤及神經細胞損傷,同時出現損傷節段以下感覺、運動及二便障礙[27]。為了降低二便障礙對運動功能恢復的影響,同時降低大鼠死亡率,本研究中大鼠脊髓損傷打擊損傷點為第10胸椎,因大鼠交感神經位于L1～2,副交感神經和軀體神經位于L6～S1,T10損傷大鼠模型可保留膀胱功能的低級神經控制,減少造模后尿潴留概率,提高大鼠存活率[28]。脊髓損傷后髓內出血明顯,神經元變性、死亡,同時灰質白質結構紊亂、邊界模糊消失[26]。由于RNA及相關酶數量增加,處于再生狀態的神經元染色質發生裂解和細胞質體積增大,RNA由大顆粒轉變為亞顯微顆粒導致尼氏小體明顯減少[27]。夾脊電針能夠改善脊髓損傷后受損節段神經元形態與功能,維持局部結構穩定或促進紊亂結構的重塑,并且能夠明顯提高脊髓損傷后大鼠BBB評分[19]。本研究中觀察到的病理變化及電針干預作用與既往報道相一致,再次證明夾脊電針能夠有效改善脊髓損。

隨著對鐵死亡的研究深入,其作用機制和發生特點被逐漸闡明。研究表明Xc-/GPX4通路是鐵死亡主要的發生途徑之一[29]。GSH和GPX4為鐵死亡負相關標志物,也是驗證鐵死亡的標志性因子[30]。SCI急性期導致局部出血后,損傷區域的鐵離子含量顯著升高,形成鐵過載后,過量的鐵和二價亞鐵離子(Fe2+)能夠與有機過氧化物ROOH或游離過氧化氫反應,生成可溶性脂烷氧基或羥基自由基[31],增加ROS積累[32]。脂質過氧化是鐵死亡的關鍵因素,細胞內的GSH減少使其抗氧化能力減弱,導致胞內過氧化物積累發生脂質過氧化,引起細胞發生鐵死亡[33]。GPX4利用其催化活性,削弱脂質過氧化物毒性,維持膜脂質雙分子層穩態;抑制GPX4導致細胞內過氧化物的堆積,引發鐵死亡[29]。作為GPX4催化過氧化物轉化為醇的協同因子,GSH缺乏會引發半胱氨酸缺乏,將直接致GPX4失活,引發鐵死亡[29]。Fer-1是鐵死亡Xc-/GPX4通路抑制劑,通過抑制脂質過氧化發揮作用。研究表明,Fer-1通過提高GSH、GPX4水平抑制細胞的鐵死亡[34]。本研究發現電針能夠提高GSH和GPX4的表達,與抑制劑Fer-1的作用一致,說明電針能夠通過抑制鐵死亡通路促進脊髓損傷。在一項心肌損傷的研究中也發現電針能通過提高GSH、GPX4表達抑制鐵死亡的發生[35]。

綜上所述,夾脊電針可改善脊髓損傷大鼠神經功能及后肢運動功能,其修復作用可能通過調節鐵死亡途徑抑制神經元死亡。因SCI的病理機制十分復雜,需更加深入地探究夾脊電針對鐵死亡通路的調控作用機制。