基于Nrf2/ARE信號通路探討夾脊電針對神經根型頸椎病模型大鼠的作用機制

楊旭霞,婁宏君,王文韜,高 曦△

1.黑龍江中醫藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院,黑龍江 哈爾濱 150040;3.山東文登整骨煙臺醫院,山東 威海 264499

神經根型頸椎病(Cervical spondylosis radiculopathy,CSR)是頸椎病分型中最為常見的一種類型,約占所有頸椎病的60%～70%[1],是常見的神經退行性病變,由頸椎間盤突出刺激或壓迫神經根所引起,造成感覺和運動功能障礙,以及一側或兩側神經根支配區域放射性疼痛[2]。據報道,CSR的發病率隨著年齡的增長而增加,50～60歲的發病率大概為0.35%[3],由于人口老齡化速度的加快以及工作方式的改變,CSR的發病年齡逐漸年輕化,嚴重影響人們的工作和生活[4]。CSR歸屬于中醫“骨痹”“項痹”的范疇,主要病機為風寒濕邪侵襲人體而致經脈氣血不通,不通則痛,電針作為一種中醫特色療法,將傳統針刺與電刺激相結合,具有理氣活血、通痹止痛的作用,臨床研究表明,電針對CSR具有良好的治療效果[5],但其作用機制尚未清楚。因此,本研究通過觀察電針頸夾脊穴對CSR所致的神經根炎癥中氧化應激因子的影響,探討夾脊電針治療CSR的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

清潔級SD健康雄性大鼠75只,體質量(300±50)g,由黑龍江中醫藥大學醫學動物實驗中心提供[實驗動物許可證編號:SYXK(黑)2021-010],實驗飼養環境溫度(22±2)℃,濕度(60±2)%,12 h循環照明,自由飲食攝水,適應性喂養1周,本研究已通過黑龍江中醫藥大學倫理委員會審查批準(編號:SLBH-2022022201)。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 丙二醛測定試劑盒、超氧化物歧化酶測定試劑盒和谷胱甘肽過氧化物酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號:A003-1;A001-3;A005-1);大鼠血紅素氧合酶(HO-1)酶聯免疫分析試劑盒(江蘇酶免實業有限公司,貨號:MM-0471R1);Nrf2兔多抗、HO-1兔多抗和Keap1兔多抗[北京博奧森生物技術有限公司,貨號:bs-1074R;bs-2075R;bs-4900R);GAPDH兔多抗(生工生物工程(上海)股份有限公司,貨號:D110016];山羊抗兔二抗(武漢三鷹生物技術有限公司,貨號:SA00001-2);BCA蛋白測定試劑盒、ECL化學發光試劑盒和PVDF膜(碧云天生物技術有限公司,貨號:P0010S;P0018AFT;FFP24);水合氯醛(天津阿爾法生物科技有限公司,貨號:A2865)等。

1.2.2 儀器 華佗牌一次性無菌針灸針(蘇州醫療用品廠有限公司,規格0.35 mm×25 mm);電針治療儀(常州英迪電子醫療器械有限公司,型號:KWD-808I);酶標分析儀(北京普朗新技術有限公司,型號:DNM-9602);電子精密天平[梅特勒﹣托利多儀器(上海)有限公司,型號:PL602S];漩渦混勻儀(群安實驗儀器有限公司,型號:VM-300S);金屬浴(群安實驗儀器有限公司,型號:MDB100C);多用脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司,型號:ts2000a);數顯穩壓穩流電泳儀(上海天能科技有限公司,型號:EPS-300);微型垂直槽多板灌膠器(上海天能科技有限公司,型號:VE-60);全自動化學發光圖像處理系統(上海天能科技有限公司,型號:Tanon-4600)等。

2 實驗方法

2.1 分組與模型制備

將75只SD大鼠隨機分為5組:空白對照組、假手術組、模型組、針刺組和實驗組,每組15只。用化學誘導法[6]對模型組、針刺組和實驗組構建CSR模型,假手術組不進行化學誘導僅進行手術,空白對照組不予任何處理。造模方法:①麻醉與固定:術前禁食12 h,大鼠經腹腔注射麻醉后取俯臥位固定于操作臺上,頸前部墊5 mL注射器,以使頸椎后突便于操作。②術前準備:致炎物選擇在0.5%的福爾馬林溶液中浸泡24 h的定量濾紙片(1 mm×1 mm),去除大鼠頸背部毛發,碘伏消毒(以T1～2正中切口為中心消毒周圍4～5 cm),然后鋪蓋無菌洞巾,顯露T1～2正中區域(T2為大鼠頸部第2個高突點)。③手術:以T1～2正中為切口,沿著棘突縱行切開皮膚和皮下組織(逐層切開),切口約2 cm,分離棘突兩側肌肉,暴露棘突和右側椎板,然后用顯微持針鉗咬去T1椎板,顯露出右側C8神經根,仔細分離神經根和周圍組織(務必不能將神經損傷),然后將用福爾馬林溶液浸泡過的定量濾紙片放在暴露的神經根腋下。假手術組僅顯露C8神經根,而不放置濾紙片,逐層縫合,關閉切口,縫合完畢后在切口處均勻涂抹阿莫西林粉末,以防術后切口感染。最終術中死亡2只,術后因腸梗阻死亡3只,故每組取12只進行后續檢測。

2.2 模型評定

2.2.1 大鼠步態評分 結合Kawakami與Dubuisson法[7-8]對其由疼痛攣縮造成的步態障礙進行評估。從造模前1 d起每日進行評定。其中正常步態、足無畸形計為1分;受損傷足輕觸玻璃臺面、不持重或輕微持重、走時跛行或足內收蜷縮畸形計為2分;受損足抬起蜷縮、走動時不著臺面計為3分。

2.2.2 抓握能力評定 從造模前1 d起每日進行評定[9]。將一根長度為20 cm、直徑0.5 cm的一次性筷子平行置于距離地面0.5 m的高度,抓取大鼠,將大鼠雙前足置于桿上,令其充分抓握后使其懸吊于桿上,用秒表記錄大鼠雙前足抓握的時間。另外,將雙前足抓握能力相近者計為1分;右前足能抓握但抓握能力明顯弱于左前足者計為2分;右前足無法抓握者計為3分。

2.3 干預方法

模型成功后,從第4天開始各組大鼠分別予以以下干預方式:空白對照組不予任何干預;假手術組、模型組予捆綁15 min,1次/d,持續10 d,針刺組俯臥位捆綁大鼠后,針刺部位消毒,使用一次性無菌針灸針針刺大鼠C6、C7雙側頸夾脊穴,穴位定位參照大鼠穴位圖譜[10],直刺0.3～0.5 cm,留針15 min,1次/d,持續10 d;電針組俯臥位捆綁大鼠后,以雙側C6、C7為一組,兩側均在針柄處連接電針儀,電流2.5 mA,疏密波,頻率50 Hz,予夾脊電針治療15 min,1次/d,持續10 d。

2.4 取材

治療結束后,大鼠經腹腔注射麻醉后仰臥位固定于操作臺上,先自腹部動脈取血,而后取C8神經根組織于-80 ℃冰箱保存。

2.5 指標檢測

2.5.1 試劑盒檢測大鼠血清MDA、SOD和GSH-PX的含量或活力 將大鼠血液靜置2 h后進行離心,抽取上層血清,用試劑盒檢測大鼠血清中MDA、SOD、GSH-PX 的含量或活力,嚴格參照說明書進行,使用DNM-9602酶標分析儀,于對應波長下讀取光密度(OD)值,根據標準曲線計算上述氧化應激因子含量或活力。

2.5.2 Western blot技術檢測神經根組織中Nrf2、Keap1和HO-1的蛋白表達 取各組大鼠神經根組織,加入蛋白提取劑(RIPA裂解緩沖液:PMSF蛋白酶抑制劑=100∶1)抽提神經根組織總蛋白,使用玻璃勻漿器于冰上充分研磨勻漿,將勻漿后的樣品于4 ℃離心機中10 000 g/min離心10 min,取上清液,用BCA法測定總蛋白濃度,加入含溴酚藍染料的上樣緩沖液和RIPA裂解緩沖液將總蛋白濃度調整至一致,然后于100 ℃金屬浴中加熱煮沸5 min。采用SD-聚丙烯酰胺凝膠電泳系統分離所測蛋白,而后采用免疫印跡中的濕轉法將蛋白轉印至PVDE膜上。將轉印后的PVDE膜在封閉液(用脫脂奶粉配制而成)中室溫搖床封閉2 h,然后加入用TBST稀釋后的一抗,于4 ℃冰箱中孵育過夜。第2天TBST洗膜5次,每次8 min。用HRP標記的二抗在室溫下孵育1 h,再次洗膜。最后將ECL工作液均勻地滴加在膜上,避光孵育1 min,使用化學發光圖像處理系統掃膜,將蛋白質條帶圖像保存下來,使用ImageJ軟件對條帶進行分析。

2.6 統計學處理

數據均采用GraphPad Prism9.5.1軟件進行統計學分析,計量資料均以均數±標準差的形式表示,多組間比較符合正態分布采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),不符合正態分布采用非參數秩和檢驗(Kruskal Wallis),組間差異比較采用Tukey’s檢驗,以P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 模型評定

造模后,空白對照組與假手術組步態評分與抓握能力評分比較差異無統計學意義;與假手術組比較,模型組、針刺組和電針組步態評分與抓握能力評分均升高,差異具有統計學意義(P<0.01),表明CSR造模成功。干預后,空白對照組與假手術組步態評分與抓握能力評分比較差異無統計學意義;與假手術組比較,模型組大鼠步態評分與抓握能力評分升高,差異具有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,針刺組和電針組大鼠的步態評分與抓握能力評分均降低,差異具有統計學意義(P<0.05);與針刺組比較,電針組大鼠步態評分和抓握能力評分優于針刺組,差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1～2。

表1 各組大鼠步態評分比較

表2 各組大鼠抓握能力評分比較

3.2 各組大鼠血清MDA含量、SOD與GSH-PX活性比較

與空白對照組比較,假手術組大鼠血清中MDA的含量、SOD和GSH-PX的活性差異不具有統計學意義(P>0.05)。與假手術組比較,模型組大鼠血清中MDA的含量顯著升高,SOD和GSH-PX的活性顯著降低,差異具有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較,針刺組和電針組大鼠血清中MDA的含量明顯降低,SOD的活性明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.05),GSH-PX的活性顯著升高,差異具有統計學意義(P<0.01)。與針刺組比較,電針組大鼠血清中MDA的含量明顯升高,SOD和GSH-PX的活性明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠MDA含量、SOD與GSH-PX活性比較

3.3 各組大鼠神經根組織Nrf2、HO-1與Keap1表達比較

與假手術組比較,模型組大鼠神經根組織Nrf2與HO-1蛋白表達水平顯著下降,Keap1蛋白表達水平顯著上升,差異具有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較,針刺組和電針組大鼠神經根組織Nrf2與HO-1蛋白表達水平顯著上升,Keap1蛋白表達水平顯著下降,差異具有統計學意義(P<0.01)。與針刺組比較,電針組大鼠神經根組織Nrf2蛋白表達水平顯著上升,差異具有統計學意義(P<0.01),HO-1蛋白表達水平明顯上升,差異具有統計學意義(P<0.05),Keap1蛋白表達水平顯著下降,差異具有統計學意義(P<0.01)。見圖1、表4。

注:A.空白對照組;B.假手術組;C.模型組;D.針刺組;E.電針組。

表4 各組大鼠神經根組織Nrf2、HO-1及Keap1蛋白表達

4 討論

中醫學中關于頸椎病的論述散見于“痹證”“痿證”“項強”“肩頸痛”等范疇中,其病機主要與風寒濕邪阻滯經絡有關,《素問·至真要大論》述:“諸痙項強皆屬于濕?！薄鹅`樞·五邪》篇有云:“邪在腎,則病骨痛,陰痹。陰痹者……肩背頸項痛,時眩?！薄峨s病源流犀燭》述:“凡頸項強痛,肝腎膀胱病也,三經受風寒濕邪”,其發病部位主要有督脈與膀胱經走行,而頸夾脊穴處這兩經之間,可溝通兩經之經氣,又含局部取穴之義,具有舒經活血、行氣止痛的功效,是臨床中治療頸椎病的常用穴位[11]。電針是將神經電生理與經絡結合而成的中醫特色療法,針刺得氣后,在針上通以微弱的連續波或斷續波,從而起到刺激穴位、治愈病癥目的,是目前治療頸椎病較為常用的一種治療方法[12]。研究已經證實了電針能夠起到緩解疼痛、減輕或消除增生物壓迫造成的炎癥和水腫和改善周圍微循環等作用[13]。電針與頸夾脊穴配合應用,可增強夾脊穴通經止痛的功效。

現代醫學認為CSR屬于椎間盤退行性病變,以頸神經根支配區域出現的根性癥狀為主要特征,既往研究發現[14],在外周組織發生炎癥反應時脊髓環氧化物酶2(COX-2)表達量增加,經夾脊電針治療后,CSR模型大鼠脊髓組織中COX-2蛋白的表達降低。通常情況下,生物體內存在正常運轉的抗氧化體系,當炎癥反應發生時,正常的抗氧化體系的平衡被打亂,氧化應激系統被激活[15],一些研究表明,核因子E2相關因子(Nrf2)通過協調炎癥細胞的招募和通過抗氧化反應元件(Antioxidant response element,ARE)調節基因表達而參與抗炎過程[16],炎癥與氧化應激反應關系密切,Nrf2參與包括氧化應激在內的多種防御機制,在炎癥反應、癌癥轉變等病理發展過程中起重要作用。Nrf2屬亮氨酸拉鏈家族,含有7個同源結構域(Neh1-Neh7)[17],其中Neh2是Nrf2與Kelch樣ECH相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)相結合的區域[18],Nrf2識別并結合ARE來啟動抗氧化通路。生理狀態下,大部分Nrf2與Keap1結合而處于失活狀態,在創傷、炎癥等刺激下,Nrf2與Keap1解離,先與小MAF蛋白(small MAF,sMAF)組合成異二聚體,再與ARE結合,啟動其下游的血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase 1,HO-1)、Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶和抗炎因子等的表達以增強機體細胞的抗氧化能力。HO-1是機體內廣泛存在的一種誘導酶,能夠分解血紅素,消耗機體內的游離氧,減少氧自由基(ROS)的生成和堆積[19]。有研究發現,在發生臂叢神經根性撕脫損傷后,脊髓前角中的Nrf2和HO-1在基因和蛋白水平上的表達隨損傷呈現一定的時序性,激活Nrf2/ARE信號通路可阻止或減輕臂叢神經根性撕脫后氧化應激反應對脊髓前角運動神經元的損傷[20]。有關椎間盤退行性變的機制研究顯示,紅景天苷可以促進Nrf2表達量增加,顯著上調TNF-α刺激下的髓核細胞中Nrf2下游的HO-1,可在人體髓核細胞中通過啟動Nrf2/ARE信號通路發揮抗氧化作用[21]。自噬是細胞重要的防御機制,與Nrf2/ARE/HO-1信號通路關系密切,p62蛋白是連接自噬與Nrf2/ARE信號通路的橋梁[22],自噬啟動可以對神經系統起到保護作用。本研究顯示,造模后大鼠出現右前足抬離地面、向胸前蜷縮的表現,步態障礙表現明顯,抓握能力受限,經夾脊電針治療后,步態基本恢復正常,抓握能力得到恢復,說明夾脊電針可以改善CSR的根性癥狀。經過夾脊電針治療后,電針組大鼠血清中MDA的含量明顯降低,SOD的活性明顯升高,GSH-PX的活性顯著升高,神經根組織中Nrf2與HO-1表達顯著上升,Keap1表達顯著下降,說明夾脊電針可以通過上調Nrf2與HO-1的表達和下調Keap1的表達實現對Nrf2/ARE通路的調控,刺激機體抗氧化應激反應發生以減輕CSR所致的根性疼痛。

綜上所述,夾脊電針可能通過激活Nrf2/ARE信號通路發揮抗氧化應激作用,減少神經細胞損傷,緩解CSR根性疼痛,進而實現保護神經的作用。這為電針防治CSR提供了理論依據。但單一信號通路并非單獨發揮作用,常常與其他通路相互聯系、相互作用,在CSR的病理過程中Nrf2/ARE通路是否與其他通路相互串聯,其具體機制有待進一步探究。