高效液相色譜法在藥品成分分析中的應(yīng)用及優(yōu)化研究

＊亓秀華

（濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心 山東 250102）

近年來，藥品的質(zhì)量和安全問題備受關(guān)注，各國政府在加強(qiáng)監(jiān)管的同時(shí)，對未取得《許可證》而生產(chǎn)、經(jīng)營藥品的企業(yè)和個(gè)人進(jìn)行了嚴(yán)厲的處罰。因此對藥品成分的準(zhǔn)確分析和監(jiān)測變得至關(guān)重要。高效液相色譜法（HPLC）作為一種廣泛應(yīng)用于藥物和化學(xué)分析領(lǐng)域的分析技術(shù)，因其高靈敏度、分離效果好和研究廣泛等優(yōu)勢，成為藥品成分分析中最常用的方法之一。

1.液相色譜法及儀器

（1）常用液相色譜儀器。第一，質(zhì)譜檢測器。質(zhì)譜檢測器（MS-detector）是液相色譜儀中的一個(gè)主要探測器。高解析物可以在離子源中電離，并按照質(zhì)荷比進(jìn)行分散，以產(chǎn)生更高靈敏度和選擇性；第二，紫外線吸收探測器。紫外線吸收探測器（UV absorption detector）可以測量產(chǎn)生紫外線吸收能力強(qiáng)的物體。一般分為恒定波長、可變波長和二極管陣列檢測三個(gè)類別，能夠滿足各種各樣的分析物；第三，光電二極管陣列檢測器。光電二極管陣列檢測器是一種高級形式的紫外檢測器。該儀器能夠同時(shí)測量多個(gè)波長的吸光度，從而提高每種分析物的檢測靈敏度[1]。

（2）樣品制備方法。高效液相色譜法樣品制備方法會(huì)直接影響到分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。為此，本文以高效液相色譜法為例，介紹一種常用的樣品制備方法。

根據(jù)待測化合物的性質(zhì)和溶解度，選擇合適的溶劑進(jìn)行樣品的溶解。準(zhǔn)確稱取一定量的待測樣品，并將其轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦小Ｗ⒁獗苊夥Q量誤差和樣品的污染。將稱好的樣品溶解在選定的溶劑中，渦旋或超聲處理以促進(jìn)樣品的充分溶解。注意控制溶解溫度和超聲功率，避免樣品分解或產(chǎn)生副反應(yīng)。若樣品中含有不溶性雜質(zhì)或固體顆粒，可以通過離心、過濾或萃取等方法將其去除，以避免對色譜柱的損害和色譜分離的影響。使用0.22μm或0.45μm的濾膜過濾樣品溶液，以去除微小的顆粒和雜質(zhì)，防止堵塞色譜柱。選擇合適的進(jìn)樣瓶，并用乙醇或甲醇等溶劑清洗干凈，晾干后備用。注意避免使用有劃痕或變形的進(jìn)樣瓶，以免影響色譜分離效果。

2.高效液相色譜法在藥品成分分析中的優(yōu)化方案設(shè)計(jì)

（1）樣品處理優(yōu)化。藥品成分分析采用固相萃取、液-液萃取、蒸餾等技術(shù)，可以將藥品樣品中的目標(biāo)成分從復(fù)雜的樣品基質(zhì)中提取出來，并達(dá)到一定的濃縮效果。提高目標(biāo)成分的測定靈敏度，消除某些干擾物質(zhì)的影響，提高峰形對稱性和信噪比[2]。藥品樣品處理過程中，可能會(huì)發(fā)生物化變化、光敏變化或降解，從而影響樣品中目標(biāo)成分的含量和測定結(jié)果。為了解決這些問題，高效液相色譜法的樣品處理、安全、操作過程簡便，處理效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)聯(lián)機(jī)操作，常見的樣品處理技術(shù)主要包括液-液萃取、固相萃取等。

第一，液-液萃取是利用不相溶的溶劑體系，將目標(biāo)成分從水溶液中抽提至有機(jī)相中的過程。這種技術(shù)可使目標(biāo)成分從復(fù)雜的樣品基質(zhì)中分離出來，并富集濃縮，提高檢測靈敏度。通常，有機(jī)相可以通過揮發(fā)性溶劑的揮發(fā)使其濃縮，減少溶劑用量和對操作人員的危害。也可以使用離子液體作為萃取劑，以減少對操作人員的危害并提高目標(biāo)成分的回收率；第二，固相萃取法是指將柱色譜和液相-固萃取法相結(jié)合的樣品處理工藝。它通過選用合適的吸收物（正相、反相、離子交換等），使目標(biāo)成分吸附于穩(wěn)定相上，然后再通過特殊的洗脫溶液除去試樣中的非目標(biāo)化合物，從而實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)元素的富集與提純。固相萃取具有樣品量少、耗溶劑少、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于基質(zhì)復(fù)雜、目標(biāo)成分含量低的樣品處理。

（2）流動(dòng)相組成優(yōu)化。首先，需要選擇適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉軇w系。溶劑的選擇應(yīng)基于目標(biāo)成分的性質(zhì)和分離要求。常見的有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、乙腈等，在藥品成分分析中常用作流動(dòng)相的溶劑。對于極性藥物的分析，酸性或堿性溶劑可以添加以調(diào)整pH值，以達(dá)到良好的分離效果。其次，溶劑的選擇及其配比應(yīng)根據(jù)藥品成分的性質(zhì)、極性及其相互作用來確定。第一類溶劑，如苯、四氯化碳、1,2-氯乙烷等，由于它們不可接受的毒性和對環(huán)境的有害作用，應(yīng)盡量避免使用；第二類溶劑，如乙腈、氯仿、二氯甲烷、環(huán)己烷等，由于其固有的毒性，必須在藥品生產(chǎn)中限制使用；第三類溶劑，如乙酸、丙酮、醋酸甲酯和四氫呋喃等，按照GMP管理和產(chǎn)品的要求正確應(yīng)用。通常，提高有機(jī)溶劑配比會(huì)增加柱的親脂性，進(jìn)而提高稀溶物的轉(zhuǎn)化速度。但是，在部分特殊情形下，提高有機(jī)溶劑配比可能造成一些組分無法溶解或分散不良，所以必須在選擇配比上加以優(yōu)化。

（3）檢測參數(shù)優(yōu)化。高效液相色譜法（HPLC）是一種廣泛應(yīng)用于藥品成分分析的分離技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)包括高分離效能、高靈敏度、高選擇性等。然而，為了得到準(zhǔn)確且可靠的檢測結(jié)果，參數(shù)優(yōu)化是必不可少的步驟。對于不同的藥品成分，流動(dòng)相的組成和比例需要進(jìn)行調(diào)整，以達(dá)到最佳的分離效果。在分析藥材中的黃酮類化合物時(shí)，采用甲醇-水-磷酸體系作為流動(dòng)相，同時(shí)調(diào)整甲醇的比例以改善分離效果。在測定抗生素類藥物時(shí)，通常選擇254nm作為檢測波長；而在測定多肽類藥物時(shí)，則可能需要選擇214nm或280nm作為檢測波長。

在黃酮類化合物的分析中，采用了甲醇-水-磷酸作為流動(dòng)相，并將甲醇的比例調(diào)整為40:60:0.1，以達(dá)到最佳的分離效果。檢測波長選擇為360nm。柱溫設(shè)定為30℃，流速為1mL/min，進(jìn)樣量為20μL。通過這些參數(shù)優(yōu)化，獲得了良好的分離效果，其中R2值表示分離效果的相關(guān)性，越接近1表示分離效果越好。通過對不同藥品成分的分析和對優(yōu)化參數(shù)的調(diào)整，得到了適用于黃酮類化合物、抗生素類藥物和多肽類藥物的最佳分析條件。這些優(yōu)化后的條件能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)成分的高效分離和準(zhǔn)確測定，為藥品分析提供了準(zhǔn)確性和效率性的保證。

3.試驗(yàn)結(jié)果與分析

（1）藥品成分分析試驗(yàn)。藥品中除主成分以外的雜質(zhì)，可能是原料藥合成過程中代入的原料、中間體、試劑、分解物、副產(chǎn)物等物質(zhì)，也可能是制劑成產(chǎn)過程或貯藏、運(yùn)輸過程中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物。由于當(dāng)前相關(guān)物質(zhì)的含量較少，所以需要選擇靈敏度高、重現(xiàn)性好的檢測方法[3]。目前主要選用高效液相色譜法測定有關(guān)物質(zhì)。高效液相色譜法在藥品成分分析中的應(yīng)用數(shù)據(jù)，見表1。

表1 高效液相色譜法在藥品成分分析中的應(yīng)用數(shù)據(jù)

條件1：等度色譜條件。等度色譜條件是指在色譜分離過程中，流動(dòng)相的組成保持恒定不變。在這種條件下，色譜柱的溫度和流速通常也保持恒定。等度色譜條件適用于分離組分間保留時(shí)間差異較大的樣品。條件2：梯度色譜條件。梯度色譜條件是指在色譜分離過程中，流動(dòng)相的組成隨時(shí)間發(fā)生變化。通常，梯度色譜采用兩種或多種不同極性的溶劑，按照預(yù)定的比例和時(shí)間程序進(jìn)行混合。這種變化呈現(xiàn)為線性/非線性。梯度色譜條件可以提高復(fù)雜樣品的分離效果，特別是對于那些保留時(shí)間相近的組分。條件3：高溫色譜條件。高溫色譜條件是指在較高的溫度下進(jìn)行的色譜分離。高溫可以提高色譜柱的分離效能和速度，降低柱壓降，縮短分析時(shí)間。

（2）試驗(yàn)結(jié)果分析。高效液相色譜法在藥品成分分析中的應(yīng)用顯示出了極高的靈敏度和重現(xiàn)性，對于藥品中微量雜質(zhì)的檢測具有顯著的優(yōu)越性。表中列出的五種藥品，在各自的色譜條件下，均能實(shí)現(xiàn)良好的分離效果，其分離度均大于1.2，這表明高效液相色譜法可以有效地分離和檢測藥品中的主成分和雜質(zhì)。同時(shí)，校正因子的數(shù)值在0.85～1.2之間，這表明在該色譜條件下，主成分和雜質(zhì)的響應(yīng)因子基本相同，因此可以通過峰面積的比較來直接反映雜質(zhì)的含量，這對于雜質(zhì)的定量檢測具有重要的意義。另外，從雜質(zhì)含量的數(shù)據(jù)來看，所有藥品的雜質(zhì)含量均低于1.5%，這表明該分析方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度，可以滿足藥品中微量雜質(zhì)的檢測需求。因此，高效液相色譜法作為一種重要的分析手段，其高靈敏度、高分離效能、高重現(xiàn)性等優(yōu)點(diǎn)使其在藥品雜質(zhì)檢測中具有無可比擬的優(yōu)勢。

（3）優(yōu)化方案驗(yàn)證。在流動(dòng)相組成優(yōu)化方面，通過試錯(cuò)法逐步調(diào)整溶劑比例，目的是找到能夠同時(shí)滿足分離和檢測的最佳條件。嘗試了甲醇-水和乙腈-水兩種溶劑體系，并通過不同比例的混合嘗試找出最佳的溶劑比例。在經(jīng)過一系列試驗(yàn)和比較后，發(fā)現(xiàn)甲醇-水（60:40）的流動(dòng)相組成能夠在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)成分的高效分離和檢測。在柱類型優(yōu)化方面，選擇了C18型柱和氰基型柱進(jìn)行對比試驗(yàn)。通過在相同的流動(dòng)相條件下，對比兩種不同柱的分離效果和峰形，發(fā)現(xiàn)C18型柱具有更好的分離效果和峰形，能夠更好地分離目標(biāo)成分和雜質(zhì)。在流速優(yōu)化方面，發(fā)現(xiàn)當(dāng)流速超過一定范圍后，分離效果開始下降。因此，選擇了使目標(biāo)成分在1.5～2.0min內(nèi)完全分離的較低流速作為最終的流速條件。流動(dòng)相組成優(yōu)化、柱類型優(yōu)化和流速優(yōu)化的數(shù)據(jù)，見表2。

表2 流動(dòng)相組成優(yōu)化、柱類型優(yōu)化和流速優(yōu)化的數(shù)據(jù)

最終，針對優(yōu)化方案進(jìn)行了驗(yàn)證，并對優(yōu)化前后的結(jié)果進(jìn)行了比較。優(yōu)化前后目標(biāo)成分峰的分離度和峰形的變化，見表3。

表3 優(yōu)化前后目標(biāo)成分峰的分離度和峰形的變化

在優(yōu)化后的條件下進(jìn)行分析，觀察到目標(biāo)成分峰的分離度明顯提高，峰形更加對稱和尖銳，并且與之前的研究相比，在相同的分析時(shí)間內(nèi)，優(yōu)化后的方案能夠更快地完成分離和檢測。

4.結(jié)論

高效液相色譜法在藥品成分分析中的應(yīng)用及優(yōu)化研究對于提高藥品分析的準(zhǔn)確性和效率具有重要的意義。優(yōu)化后的分析條件能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)成分和雜質(zhì)的高效分離和準(zhǔn)確測定，提高了分析效果和準(zhǔn)確性。同時(shí)，高效液相色譜法具有操作簡便、分辨率高并且靈敏度好等優(yōu)點(diǎn)，使其在藥品成分分析中得到廣泛應(yīng)用。未來，新型柱材料和新的分離機(jī)制的開發(fā)將進(jìn)一步提升分析性能。分離機(jī)制的研究也將拓寬高效液相色譜法在藥品成分分析中的應(yīng)用范圍，并提供更靈敏的檢測方法。