PI3K/Akt/FoxO1信號通路對人源肺動脈平滑肌細胞及肺動脈高壓大鼠細胞凋亡的影響

高璐陽 金旗,2 張毅,3 李欣 黃志華 章思鋮 段安琪 趙智慧 趙青 羅勤

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 國家心血管病中心 阜外醫院 呼吸與肺血管病診治中心,北京 100037;2.復旦大學附屬中山醫院 上海市心血管病研究所心內科,上海 200032;3.電子科技大學附屬四川省人民醫院重癥監護科,四川 成都 610072)

肺動脈高壓(pulmonary hypertension,PH)是一種常見的血流動力學異常狀態、嚴重的心血管疾病,可累及全身多個系統。其特征為肺動脈壓異常升高、肺血管阻力不斷增加,導致肺血管重構,并損害右心泵血能力,最終可能導致右心衰竭和死亡[1]。由于現有的靶向藥物主要作用于舒張血管通路,因此,有必要探索發病機制,以發現直接針對肺動脈重構的治療目標[2]。有研究[3]證實,阻止肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cell, PASMC)凋亡在肺動脈重構中起重要作用。有研究[4]顯示,磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)信號通路在細胞生長、增殖、凋亡、侵襲和遷移等多個病理生理過程中起重要作用,并與血管重構密切相關。在該信號通路中,叉頭框蛋白O1(forkhead box protein O1, FoxO1)是Akt的下游目標蛋白。研究[5]表明,FoxO1在肺血管中的表達水平降低可能引發肺血管重構。因此,筆者提出了“PI3K/Akt信號通路可能通過下調轉錄因子FoxO1抑制PASMC凋亡”的科學假設。筆者計劃從細胞和動物水平進行研究,以探究PI3K/Akt/FoxO1信號通路在PH發病機制中的作用,并希望找到新的治療靶點。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

人源肺動脈平滑肌細胞(human pulmonary artery smooth muscle cell, hPASMC)購自美國模式培養物集存庫,貨號PCS-100-023。使用的試劑包括胰酶-乙二胺四乙酸、磷酸鹽緩沖液、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體和抗小鼠抗體、二喹啉甲酸蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天公司),胎牛血清(GIBCO公司,美國),平滑肌細胞培養基(Sciencell公司,美國),野百合堿(monocrotaline, MCT)(Sigma公司,美國),Bcl-2抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體、Akt抗體、磷酸化Akt抗體、PI3K抗體(Proteintech公司,美國),裂解的胱天蛋白酶3(cleaved caspase-3)抗體(CST公司,美國),磷酸化FoxO1抗體、FoxO1抗體(Abcam公司,英國),細胞計數試劑盒(DoJinDo,日本),Transwell嵌套(帶聚碳酸酯膜,尺寸為6.5 mm,孔徑為8.0 μm)(Costar 3422),結晶紫染液(武漢谷歌生物),一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物)。

1.2 實驗動物

選取無特定病原體級成年雄性SD大鼠(8～10周齡),購于北京華阜康生物科技有限公司。倫理批件號為Fw-2021-0026。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

hPASMC在平滑肌細胞培養基中培養,在恒溫培養箱中以5% CO2、37 ℃和飽和濕度條件下松蓋培養。每隔1～2 d更換培養液,當細胞生長到80%鋪滿時再進行消化和傳代。

1.3.2 細胞分組與處理

將hPASMC分為4組:空白對照組、血小板源性生長因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)組、PDGF-BB+LY294002組和PDGF-BB+紫杉醇(paclitaxel)組。空白對照組不接受任何額外處理;PDGF-BB組接受20 ng/mL的PDGF-BB處理;PDGF-BB+LY294002組接受20 ng/mL的PDGF-BB處理,并用濃度梯度為10、20、30 μg/mol的LY294002(PI3K抑制劑)處理24 h;PDGF-BB+paclitaxel組接受20 ng/mL的PDGF-BB處理,并用10 μg/mol的paclitaxel(FoxO1激動劑)處理24 h。

1.3.3 動物分組與處理

將12只SD大鼠隨機分為4組:空白對照組、MCT組、MCT+LY294002組和MCT+paclitaxel組。空白對照組僅在大鼠頸背部皮下注射生理鹽水,其余3組大鼠均在頸背部皮下注射60 mg/kg的MCT,MCT+LY294002組額外接受25 mg的LY294002處理,MCT+paclitaxel組在注射MCT后的第1、7、14和21天額外接受6 mg/kg的paclitaxel處理。

1.3.4 TUNEL染色檢測細胞凋亡

將空氣干燥的hPASMC樣本使用4%多聚甲醛室溫固定20～30 min,并用磷酸鹽緩沖液洗滌3次。按照TUNEL細胞凋亡試劑盒的說明書進行實驗,最后使用倒置顯微鏡拍照觀察,計算TUNEL陽性細胞在總細胞中的比例。

1.3.5 蛋白質印跡法檢測細胞Bcl-2和cleaved caspase-3表達水平

消化離心收集各組細胞沉淀并裂解,以4 ℃和12 000 r/min離心5 min收集細胞;使用二喹啉甲酸法對蛋白進行濃度定量。每孔上樣100 μg細胞總蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜,使用5%脫脂奶粉溶液封閉2 h,根據蛋白分子量剪下適當的膜帶,分別與相應的一抗在4 ℃孵育過夜。帶有吐溫20的三乙醇胺緩沖鹽水溶液洗膜15 min,重復3～4次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1：1 000),37 ℃孵育2 h,再次洗膜后加入電化學發光試劑,在聚偏氟乙烯膜上滴加工作液,待熒光帶明顯后,放入天能全自動化學發光分析儀中曝光并拍照。

1.3.6 蛋白質印跡法檢測大鼠肺組織Bcl-2、cleaved caspase-3、PI3K、磷酸化Akt、FoxO1及磷酸化FoxO1表達水平

從-80 ℃冰箱中取出大鼠肺組織,剪取部分組織轉移到1.5 mL EP管中剪碎。每管加入250 μL裂解液,在冰上裂解45 min。其余步驟同1.3.5。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 PI3K/Akt信號通路對hPASMC凋亡的影響

如圖1所示,采用TUNEL法檢測各組hPASMC的凋亡情況,以探究PI3K/Akt信號通路對hPASMC凋亡的影響。結果顯示,相比于空白對照組,PDGF-BB+LY294002組及PDGF-BB+paclitaxel組凋亡率均顯著增加(P<0.01)。

注:control,空白對照組;DAPI,4’,6-二脒基-2-苯基吲哚;**表示P<0.01。圖1 TUNEL法測定hPASMC的凋亡水平

2.2 各組hPASMC的Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達情況

采用蛋白質印跡法檢測Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白的表達水平。結果如圖2所示,PDGF-BB+LY294002組和PDGF-BB+paclitaxel組hPASMC的Bcl-2蛋白表達水平均顯著低于PDGF-BB組(P<0.01),且PDGF-BB+paclitaxel組Bcl-2蛋白表達水平高于PDGF-BB+LY294002組(P<0.01)。相反,相比于PDGF-BB組,PDGF-BB+LY294002組和PDGF-BB+paclitaxel組hPASMC的cleaved caspase-3表達水平更高(P<0.01),且PDGF-BB+paclitaxel組cleaved caspase-3表達水平低于PDGF-BB+LY294002組(P<0.01)。

注:control,空白對照組;GAPDH,甘油醛-3-磷酸脫氫酶;**表示 P<0.01。圖2 各組hPASMC的Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達水平

2.3 各組大鼠肺組織Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達情況

采用蛋白質印跡法檢測大鼠肺組織Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白的表達水平。結果如圖3所示,MCT+LY294002組和MCT+paclitaxel組大鼠肺組織的Bcl-2蛋白表達水平均顯著低于MCT組(P<0.01),且MCT+paclitaxel組Bcl-2蛋白表達水平高于MCT+LY294002組(P<0.05)。相反,相比于MCT組,MCT+LY294002組和MCT+paclitaxel組的cleaved caspase-3蛋白表達水平更高(P<0.01),且MCT+paclitaxel組cleaved caspase-3蛋白表達水平低于MCT+LY294002組(P<0.01)。

注: control,空白對照組;GAPDH,甘油醛-3-磷酸脫氫酶;**表示P<0.01,*表示P<0.05。圖3 各組大鼠肺組織Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達水平

2.4 各組大鼠PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達情況

采用蛋白質印跡法檢測大鼠肺組織PI3K/Akt信號通路相關蛋白。結果如圖4所示,MCT+LY294002組和MCT+paclitaxel組大鼠肺組織的FoxO1表達水平均顯著高于MCT組(P<0.01),磷酸化FoxO1表達水平均低于MCT組(P<0.01)。MCT+LY294002組和MCT+paclitaxel組大鼠肺組織的磷酸化Akt與Akt表達水平比值均顯著低于MCT組(P<0.01)。此外,各組之間PI3K表達水平無顯著差異。

注: control,空白對照組;GAPDH,甘油醛-3-磷酸脫氫酶;p-Akt,磷酸化Akt;p-FoxO1,磷酸化FoxO1。**表示P<0.01,*表示P<0.05。圖4 各組大鼠肺組織PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達水平

3 討論

研究數據提示PI3K/Akt/FoxO1信號通路可能在PASMC異常凋亡中發揮作用,研究結果表明PDGF-BB+LY294002組和PDGF-BB+paclitaxel組的hPASMC抗凋亡能力下降。蛋白質印跡法檢測結果顯示,在PI3K抑制劑作用后,FoxO1的總量增加,磷酸化FoxO1表達水平降低;在FoxO1激動劑作用后,FoxO1表達水平升高,但磷酸化FoxO1表達水平無明顯變化。動物實驗中也觀察到類似效應。本研究的創新之處在于從細胞和動物兩個層面首次探究了PI3K/Akt/FoxO1信號通路在肺血管重構過程中的作用及其對凋亡表型的影響。

PH病因復雜多樣,病情進展迅速,常導致患者的生活質量下降并增加短期死亡風險[6]。隨著對PH發病機制的探究,PASMC異常生物學行為導致的肺動脈重構被認為是該疾病發生與發展的重要環節。既往研究指出了細胞凋亡異常在肺動脈重構中的重要作用。有研究[7]顯示,在PH患者的PASMC中,沉默核異質核糖核蛋白A2B1基因會導致攜帶A2B1基序的信使RNA減少,從而導致細胞增殖和抗凋亡能力下降。同樣,Schuoler等[8]發現缺氧誘導的PH小鼠肺組織中水通道蛋白1 的上調進一步增加了hPASMC的凋亡,這種作用與腫瘤抑制基因p53的高表達有關。肺血管重構一旦發生,幾乎是不可逆的,是PH治療中的關鍵和難點[9]。因此,深入了解肺血管重構機制對于治療PH具有至關重要的意義。

PI3K/Akt通路廣泛存在于細胞中,調節細胞生長、增殖、分化、凋亡和免疫炎癥等眾多病理生理過程[10]。先前的研究已證實PI3K/Akt信號通路與PH密切相關。在MCT大鼠模型中發現,通過抑制PI3K/Akt信號通路來減輕肺血管重構可能是由于泛素蛋白酶體功能抑制引起的[11]。黃芩苷可通過增加腺苷A2A受體的活性來抑制PI3K/Akt信號通路,從而緩解低氧誘導的PH[12]。饑餓激素可通過激活PI3K/Akt信號通路抵抗低氧誘導的hPASMC凋亡,并參與PH的發生[13]。Li等[14]通過在paclitaxel(FoxO1激動劑)晶體納米粒子上加載活性蛋白,并使用一層葡糖醛酸包被,成功制備出一種可靶向PASMC的復合制劑——葡萄糖轉運蛋白1。這種復合制劑通過抑制細胞周期進程和促進細胞凋亡來逆轉肺動脈重構,并改善大鼠的血流動力學參數。在小鼠模型中發現,Maresin 1通過LGR6(糖蛋白激素受體家族成員之一)來抑制Akt和FoxO1磷酸化,從而阻止PASMC增殖并促進細胞凋亡[15]。此外,有研究[16]證明在自體血栓造模下形成的慢性血栓栓塞性PH大鼠模型中,FoxO1和細胞凋亡對其發病機制起重要作用。由于PH患者終末期可能發展為右心衰竭甚至全心衰竭,可推測靶向PI3K/Akt/FoxO1通路可能有助于改善PH患者的預后。

綜上所述,本研究認為PI3K/Akt信號通路可能通過下調轉錄因子FoxO1影響PASMC的凋亡,從而參與PH的發生與發展。未來可探索PI3K/Akt信號通路影響的更多表型與PH發病的關系,以深入挖掘PH的發病機制,尋找潛在的治療靶點。