線粒體動力相關蛋白1與動脈粥樣硬化研究進展

劉小雨 龐樹朝 江楊楊 王麗欣

(天津中醫藥大學第一附屬醫院 國家中醫針灸臨床醫學研究中心,天津 300193)

心血管疾病發病率逐年上升,2019年在農村和城市中心血管疾病分別占中國居民死因的46.74%和44.26%,中國正面臨人口老齡化和代謝危險因素的雙重壓力,心血管疾病負擔仍將持續增加[1]。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是心血管疾病患病率和死亡率最高的疾病之一,動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的發生和發展涉及血管內皮細胞功能障礙、血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖、巨噬細胞脂質過載形成泡沫細胞等多種機制。線粒體是一種高度動態的細胞器,其不斷地進行分裂與融合的動態平衡過程被稱為“線粒體動力學”。在各種因素影響下,線粒體動力學極易失衡,尤其是分裂異常所導致的線粒體功能障礙與AS的發生和發展密切相關。調控線粒體分裂的蛋白包括動力相關蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)、線粒體分裂蛋白1以及線粒體分裂因子等,其中起關鍵作用的是Drp1。有研究[2]表明敲除Drp1可抑制凋亡蛋白胱天蛋白酶3活化,減輕血管內皮功能損傷;相反,Drp1的過表達則可升高內皮細胞內活性氧(reactive oxygen species ,ROS)水平,加速AS進展。由此可見Drp1在AS過程中扮演著重要角色,而Drp1如何參與AS的病理發展卻鮮有關注,現就Drp1介導AS進展具體機制及靶向Drp1治療AS現狀進行綜述。

1 線粒體結構

線粒體是一種存在于大多數真核細胞中的半自主細胞器,具有雙層膜結構,即高滲性的線粒體外膜和低滲性的線粒體內膜。前者是線粒體最外層單位膜,厚度為6～7 nm,包含分選和組裝機器復合體、線粒體外膜轉位酶復合體及孔蛋白3個整合蛋白家族,主要負責線粒體的信號傳遞;后者是線粒體外膜內側的單位膜,其向內折疊形成嵴,從而增加內膜面積,使更多的反應能在內膜上進行[3]。線粒體嵴通過嵴連接與線粒體內膜連接,且嵴上錨定著呼吸鏈電子傳遞鏈復合物蛋白和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)合酶,其通過氧化磷酸化作用產生ATP,為細胞的正常代謝活動提供能量[4]。線粒體外膜與粒體內膜又將細胞器分為線粒體基質和膜間空間,線粒體基質包含許多生物分子,如參與三羧酸循環、脂肪酸氧化和氨基酸降解等生化反應的酶、線粒體DNA、線粒體RNA和線粒體核糖體等[4-5]。

2 線粒體動力學

線粒體不僅是真核生物的“能量工廠”,還是機體代謝樞紐和信號轉導平臺,在調節細胞內鈣穩態、磷脂合成、ROS生成和維持、鐵硫簇合物的生物合成和固有免疫信號轉導等生物過程中扮演重要角色[6-7]。線粒體功能受線粒體動力學的操控,主要包括線粒體融合和線粒體分裂。前者不僅可對線粒體受損部分進行動態修復,而且使細胞器共享蛋白質、線粒體DNA等代謝物。相反,當線粒體受到不可逆損傷并對細胞產生潛在有害性時,則發生線粒體分裂,即將受損的線粒體分割成小的球形細胞器,進而在線粒體自噬下進行分離和消化以維持健康的線粒體網絡[8]。

3 Drp1的結構與活性調控

線粒體分裂是細胞產生線粒體的重要方式,也是清除受損線粒體、維持線粒體正常功能的重要手段,該過程主要由Drp1介導。Drp1是一種廣泛分布于細胞質中的鳥苷三磷酸(guanosine triphosphate,GTP)酶蛋白,其以多種可變剪接變體的形式表達于哺乳動物的心臟、骨骼肌、腦、腎和睪丸中[9]。Drp1由4個結構域組成:C端GTP酶效應結構域、可變結構域、螺旋中間結構域和N端GTP酶結構域[10]。由于Drp1缺乏與脂質相互作用的普列克底物蛋白同源結構域,其只能通過線粒體分裂蛋白1、線粒體分裂因子、線粒體動力蛋白49/51等相關銜接蛋白才能從細胞膜被運送至線粒體外膜進行寡聚化,形成一個內徑約為20 nm的螺旋環,并轉運至分裂位點,以GTP依賴性方式收縮細胞器,最終母體細胞器分成兩個子體,完成線粒體分裂全過程[11]。此外,Bcl-2腺病毒/E1B 19kD相互作用蛋白3、髓樣細胞白血病-1以及含FUN14結構域蛋白1也被證明可招募Drp1到線粒體外膜,啟動線粒體分裂[12]。

Drp1介導的線粒體分裂受多種翻譯后修飾(post-translational modification,PTM)的嚴格調控,例如磷酸化、SUMO化、泛素化、棕櫚酰化和亞硝酰化等。這些PTM主要位于Drp1可變結構域,在Drp1的激活、蛋白質穩定性、蛋白質之間的相互作用、GTP酶活性以及細胞質和線粒體外膜之間的轉運中發揮重要作用[13]。磷酸化是Drp1最典型的PTM之一,目前已鑒定了許多磷酸化位點:Ser579、Ser40、Ser585、Ser44、Ser592、Ser656、Ser616、Ser637和Ser693等。其中Ser616的磷酸化是促進Drp1定位到線粒體外膜的關鍵,該過程由Rho相關蛋白激酶、蛋白激酶Cδ、細胞周期蛋白依賴性激酶1、細胞外調節蛋白激酶1/2、鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ催化[11]。值得一提的是,雙特異性磷酸酶6可獨立于細胞外調節蛋白激酶1/2對Ser616進行去磷酸化,不過此作用在氧化條件下會被去SUMO化修飾破壞[14]。Drp1的SUMO化包括兩種途徑:一種是線粒體錨定蛋白連接酶依賴的SUMO1修飾;另一種是Sentrin/SUMO特異性蛋白酶依賴的去SUMO2/3修飾,去SUMO2/3修飾不僅可促進線粒體分裂、鈣攝取、細胞色素C的釋放,還可激活線粒體自噬。相反,Drp1進行SUMO2/3修飾和去SUMO1修飾則可抑制ATP生成,提高受損線粒體比例[13,15]。

4 Drp1是AS的重要驅動因素

Drp1與一氧化氮(nitric oxide,NO)、ROS、鈣離子水平和細胞凋亡等因素密切相關,而這些因素穩態失衡可引起內皮細胞損傷、VSMC的增殖和遷移、巨噬細胞分泌炎癥因子以及介導的膽固醇逆轉運障礙等AS的相關病理特征出現(見圖1)。

圖1 Drp1參與AS的機制

4.1 Drp1與內皮細胞

內皮細胞可通過膜受體感知血流動力學變化并分泌血管活性因子,維持血管穩態。NO是內皮細胞發揮依賴性舒張功能的關鍵刺激因子,過表達的ROS不僅可干擾內皮細胞的NO信號轉導,增加血管壁張力,而且可使內皮細胞細胞間連接丟失,內皮通透性增強,促使AS的形成[16-17]。由此可見,ROS過量及NO不足是導致內皮細胞損傷的首要原因,而抑制Drp1的表達可拮抗這一過程。抑制Drp1的表達會降低煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4水平,并提高主動脈內皮細胞中NO水平,防止內皮損傷[18];反之,Drp1的過表達可促進線粒體ROS產生,過量的ROS又可通過激活c-Jun氨基端蛋白激酶信號通路增強Drp1磷酸化,使內皮細胞內線粒體分裂過度,從而形成惡性循環,導致內皮細胞死亡[19]。此外,內皮細胞衰老及其誘發的炎癥反應也是AS的誘導因素之一,Drp1亦參與了此環節。Forrester等[20]在腫瘤壞死因子-α誘導的內皮細胞中發現,抑制Drp1的活性或表達可抑制核因子κB激活、血管細胞黏附分子-1表達以及這些促炎因子誘導的白細胞黏附。

4.2 Drp1與VSMC

平滑肌細胞位于血管中膜,是構成血管壁組織結構和維持血管張力的主要細胞類型。VSMC在各種調節因子的刺激下發生表型轉換、異常增殖,進而形成纖維帽,導致內膜增生,促進AS的形成。VSMC的增殖和遷移依賴于肌動蛋白細胞骨架和肌球蛋白運動功能的重組,此過程的大部分能量均由線粒體提供,且多項研究表明Drp1作為線粒體動力學中至關重要的一員,與VSMC的增殖和遷移、表型轉化密切相關。一方面,過表達的Drp1導致其Ser616磷酸化增加,與線粒體外膜結合加快,進而影響VSMC的能量代謝和表型轉變、促進VSMC的增殖和遷移;離體的主動脈環測定也證明了抑制Drp1對VSMC具有顯著的抗增殖作用和抗遷移效應[8,21]。另一方面,Drp1的表達下調可抑制VSMC向成骨樣細胞轉化,緩解血管鈣化[22]。值得一提的是,Drp1還是啟動線粒體自噬的關鍵蛋白,盡管線粒體自噬通常在VSMC穩態中起積極作用,但有研究[23]表明上調Drp1的表達和下調線粒體融合蛋白1、線粒體融合蛋白2、視神經萎縮蛋白1的表達可協助線粒體自噬,加速VSMC的增殖。

4.3 Drp1與巨噬細胞

巨噬細胞是機體固有免疫系統中重要細胞成分,其通過清道夫受體識別并吞噬脂質,形成泡沫細胞,構成纖維斑塊,并在各種趨化因子作用下向不同方向極化,調節炎癥因子比例,介導AS全程[24]。多項研究證明Drp1的表達水平可影響巨噬細胞參與的炎癥反應、膽固醇逆轉運及細胞凋亡過程。其一,下調Drp1表達可抑制Toll樣受體2/4、糖原合酶激3β介導的核因子κB途徑及核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3途徑,下調巨噬細胞的巨噬細胞經典活化型/替代活化型比率,降低腫瘤壞死因子-α等促炎介質水平[25-27]。其二,抑制巨噬細胞中Drp1介導的線粒體分裂可下調CD36的表達、上調ATP結合盒轉運體A1的表達,促進膽固醇外流[28]。其三,抑制Drp1的表達可減少CD137信號誘導的凋亡巨噬細胞的數量,減輕斑塊負擔[29]。盡管以上各種證據均指向Drp1水平與巨噬細胞的促AS性呈正相關,仍有相反觀點提出,即Drp1可加快巨噬細胞對凋亡細胞的持續清除。Wang等[30]發現將凋亡細胞添加至巨噬細胞后,Drp1的表達迅速增加,吞噬溶酶體降解凋亡細胞尸體及鈣依賴性囊泡運輸速度加快;相反,在Drp1表達缺陷的巨噬細胞中,線粒體鈣大量流失,胞葬功能受損,病灶處凋亡細胞堆積。

5 靶向Drp1可作為潛在的治療AS途徑

大量研究表明靶向Drp1日益成為治療AS的新興方向。線粒體分裂抑制劑1(mitochondrial division inhibitor-1,Mdivi-1)是Drp1的小分子活性抑制劑,其通過抑制PTM以及線粒體膜轉位抑制Drp1與線粒體膜相互作用。研究[31]表明牙齦卟啉單胞菌具有促AS作用,而Mdivi-1可成功阻斷該厭氧菌導致的Drp1(Ser616)磷酸化、線粒體ROS積累、線粒體膜電位及ATP水平降低。此外,Mdivi-1還具有降脂、抑制血管鈣化之功效。在AS小鼠模型中,Mdivi-1不僅可減緩血管鈣化,還有抑制內質網重塑、維持肝臟蛋白穩態的作用,故Rogers等[32]將Mdivi-1定義為新型小分子前蛋白轉化酶枯草溶菌素9抑制劑。Fang等[33]發現Mdivi-1可降低線粒體分裂頻率,顯著拮抗氧化低密度脂蛋白對VSMC線粒體形態和功能造成的損傷,抑制VSMC泡沫化。然而,Bordt等[34]對Mdivi-1的特異性提出了質疑,他們發現Mdivi-1可通過不依賴于Drp1途徑抑制線粒體呼吸鏈復合體1。不過此觀點尚存在爭議,因為Aishwarya等[35]在暴露于Mdivi-1及敲除Drp1的大鼠心肌細胞中發現呼吸鏈復合體1的水平也同樣下降。因此需更多的大型動物模型研究來驗證Mdivi-1的潛在目標效應。

除了Mdivi-1,還有一些激素、中藥及其提取物被證明可通過Drp1依賴性途徑減緩AS進程。最新研究[36]發現,補陽還五湯可通過調節AMP活化蛋白激酶/Drp1途徑減少線粒體分裂來抑制AS。補骨脂異黃酮是補骨脂的主要活性成分,其可通過調節mTOR/Drp1信號級聯反應抑制血小板衍生生長因子誘導的VSMC增殖和遷移,減輕ApoE基因缺陷小鼠的AS病變[37];冬青素A是毛冬青的主要活性成分,其可通過核轉錄因子紅系2相關因子2途徑促進蛋白酶體亞基β5型的表達,降低Drp1水平,改善內皮細胞功能障礙[38]。褪黑素及鳶尾素這兩種激素被證明均可通過AMP活化蛋白激酶/Drp1信號轉導抑制VSMC向成骨樣細胞轉化,減弱動脈血管鈣化[22,39]。CDGSH鐵硫結構域1是一種鐵硫線粒體外膜蛋白,其依賴Drp1途徑才能發揮降低血清低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯水平和降低AS面積的作用[40]。

6 總結與展望

Drp1的表達在AS進展中起重要作用,相關機制目前主要集中于其與內皮細胞受損、VSMC增殖和遷移及巨噬細胞的關系。其一,表達增加的Drp1通過促進氧化應激、抑制NO信號轉導促進內皮細胞損傷,并以多種方式促進內皮細胞衰老。其二,過表達的Drp1既可通過調控能量代謝、表型轉化及線粒體自噬促進VSMC的增殖和遷移,又可促進VSMC向成骨樣細胞轉化、緩解血管鈣化。其三,表達缺陷的Drp1可通過促進巨噬細胞向替代活化型方向極化、抑制炎癥因子表達以抑制局部炎癥反應,還可促進膽固醇外流及減少凋亡的巨噬細胞數量。然而,有學者提出表達缺陷的Drp1會削弱巨噬細胞在胞葬過程中降解內化的凋亡細胞的能力,因此如何把握好且利用巨噬細胞有效的胞葬作用是通過Drp1減緩AS的未來研究方向。此外,Mdivi-1及部分中藥提取物被證明依賴于Drp1途徑減緩AS進程,不過Mdivi-1的下游靶點尚存在爭議,仍需不斷探索。相信隨著研究的不斷深入,Drp1可作為AS治療靶點,開辟新的領域。