低氧誘導因子-1在低氧性肺動脈高壓中的研究進展

金鴻錦 盧義 丁彥春

(大連醫科大學附屬第二醫院,遼寧 大連 116021)

低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是由缺氧引起的肺動脈壓力進行性升高的肺血管疾病。長期慢性HPH可引起右心室后負荷增加,最終導致不可逆性右心衰竭甚至死亡,嚴重威脅患者生命。肺血管受到低氧刺激時的早期反應為肺血管收縮,稱為低氧性肺血管收縮(hypoxic pulmonary vasoconstriction,HPV),其生理意義在于減少缺氧肺組織的血流,將血流重新分配至通氣較好的肺組織,從而維持正常的通氣/血流比值,保持良好的氣體交換功能[1]。然而,長期暴露于低氧環境可引起機體慢性缺氧,慢性缺氧通過誘導肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMC)和肺動脈內皮細胞(pulmonary artery endothelial cells,PAEC)增殖、凋亡失衡和代謝改變,引起不可逆性的低氧性肺血管重塑(hypoxic pulmonary vascular remodeling,HPVR),最終導致肺動脈高壓的形成和進展。因此,HPV和HPVR是HPH發生和發展過程中的關鍵病理生理機制。

低氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)-1是維持細胞氧穩態的核心轉錄因子,可調控數百個氧依賴性靶基因的轉錄。HIF-1可促進細胞糖代謝模式的轉變,調節細胞膜表面離子通道活性、肺血管收縮及舒張因子活性等,調節機體對缺氧的適應性反應,參與HPH的發生和進展。現對HIF-1及其下游信號分子在HPH發生和發展中的作用機制進行綜述。

1 低氧狀態下HIF-1產生增多的機制

HIF-1是高度保守的轉錄因子,幾乎表達于所有的組織細胞中。HIF-1是由具有氧感知功能的HIF-1α亞基和組成性表達的HIF-1β亞基構成的異源性二聚體。HIF-1α是HIF-1的活性亞基,其表達水平受細胞內氧濃度的調節。HIF-1α中含有兩種不同的羥基化位點,分別是2個位于氧依賴性降解結構域的脯氨酸殘基(Pro402和Pro564)和1個位于C端轉錄激活域的天冬酰胺殘基(Asn803),可分別被脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase,PHD)及HIF抑制因子羥基化[2]。常氧狀態下,PHD能誘導HIF-1α脯氨酸殘基羥基化[3],然后與von Hippel-Lindau蛋白結合,招募E3泛素蛋白連接酶使其泛素化,最后通過蛋白酶體降解[4],導致HIF-1α的表達減少。HIF抑制因子是調節HIF-1α轉錄活性的關鍵蛋白,可促進HIF-1α天冬酰胺殘基羥基化,阻止HIF-1與缺氧反應元件中輔助因子p300/CREB結合蛋白結合,從而抑制HIF下游靶基因的轉錄[5]。故常氧狀態下,HIF-1的表達水平及轉錄活性均較低。

低氧狀態下,PHD的活性降低,相關機制可能包括:(1)PHD誘導HIF-1α羥基化的過程需要氧氣參與,因此低氧狀態下PHD引起HIF-1α的羥基化減少。(2)低氧狀態下,三羧酸循環中琥珀酸脫氫酶活性降低,導致琥珀酸轉換為延胡索酸減少,線粒體中琥珀酸鹽水平升高,被琥珀酸轉運蛋白轉運至細胞質內[6],琥珀酸鹽對PHD具有濃度依賴性的抑制作用[7]。(3)低氧可能誘導線粒體復合體Ⅲ產生活性氧(reactive oxygen species,ROS)[8],大量的ROS從線粒體轉運至細胞質內,ROS可能導致PHD3的活性降低[9]。故低氧狀態下PHD活性降低,引起HIF-1α羥基化減少,導致HIF-1α降解減少、穩定性增加,HIF-1α進入細胞核內與HIF-1β結合形成穩定的HIF-1二聚體,HIF-1二聚體再與靶基因的缺氧反應元件結合,通過p300/CREB結合蛋白輔助因子的銜接,形成轉錄復合物,與低氧反應元件結合,激活下游靶基因的轉錄過程[10],參與HPH的發生和進展。

2 HIF-1參與HPH的機制

2.1 HIF-1引起細胞糖代謝模式的轉變

在HPH中觀察到,PASMC及PAEC表現出與腫瘤細胞相似的糖代謝模式的轉變,即使在有氧條件下也會表現為糖酵解途徑增強而糖有氧氧化減弱,該現象稱為Warburg效應[11]。HIF-1可調控多種與糖酵解過程相關的酶的活性,促進細胞糖代謝模式由糖有氧氧化轉變為糖酵解,其機制包括:(1)HIF-1上調葡萄糖轉運蛋白的表達,促進細胞對葡萄糖的攝取,但由于糖有氧氧化減少,細胞內葡萄糖含量的增加為糖酵解途徑提供了更多的底物,促進了糖酵解途徑[12]。(2)HIF-1促進糖酵解關鍵酶包括己糖激酶、磷酸果糖激酶-1、丙酮酸脫氫酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase,PDK)-1的表達,促進糖酵解過程。PDK-1可通過磷酸化抑制丙酮酸脫氫酶的活性,使得丙酮酸分解為乙酰輔酶A的數量減少,進入三羧酸循環的乙酰輔酶A不足,抑制了糖有氧氧化過程,并將丙酮酸重新導向糖酵解過程[5]。此外,HIF-1可促進6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase 3,PFKFB3)基因的表達,PFKFB3 可促進果糖-6-磷酸轉化為果糖-2,6-二磷酸,而果糖-2,6-二磷酸是磷酸果糖激酶-1最有效的變構激活劑[13],PFKFB3介導的糖酵解過程促進PAEC釋放生長因子和促炎細胞因子,促進PASMC的增殖和肺血管的炎癥反應[14]。(3)HIF-1促進乳酸脫氫酶的表達,加速丙酮酸分解為乳酸,促進細胞的糖酵解過程。HIF-1對于糖酵解過程中關鍵酶的調節如圖1。

注:GLUT,葡萄糖轉運蛋白;HK,己糖激酶;PFK-1,磷酸果糖激酶-1;PDH,丙酮酸脫氫酶;LDH,乳酸脫氫酶。圖1 HIF-1調控糖酵解過程相關酶的示意圖

HIF-1參與Warburg效應的機制可能與磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,PI3K/Akt/mTOR)信號通路有關。PI3K/Akt/mTOR信號通路在調節Warburg效應中發揮關鍵作用,mTOR通過促進HIF-1的表達放大Warburg效應[15],血小板源性生長因子可通過激活PASMC增殖中的PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α通路促進Warburg效應[16]。HIF-1可能作為PI3K/Akt/mTOR通路的下游信號分子,調節糖酵解過程中關鍵酶的活性,促進細胞攝取葡萄糖,提高糖酵解過程中關鍵酶的活性,從而促進葡萄糖的糖酵解過程。且HIF-1可使丙酮酸分解為乙酰輔酶A的數量減少,減少了三羧酸循環的原料,抑制了糖有氧氧化的過程。因此,HIF-1的激活是促進細胞糖代謝模式轉變的重要開關。糖有氧氧化途徑受到抑制能減少缺氧引起的ROS產生,降低了ROS對于細胞內蛋白質、脂質和DNA等大分子的毒性作用[17]。糖酵解途徑的增強導致PASMC能量產生效率降低,能量供應相對不足,使PASMC表現出過度增殖及抗凋亡的特性[18],糖酵解途徑導致乳酸堆積,通過上調組蛋白乳酸化而促進PASMC的增殖[9]。HIF促進細胞糖代謝模式的轉變,其意義在于減少細胞耗氧量,適應HPH引起的低氧環境,但也同時引起PASMC的增殖和凋亡失衡,導致了肺血管重塑的發生。

2.2 HIF-1調節細胞膜表面離子通道活性

細胞內鈣離子濃度增加是引起PASMC收縮的主要因素,也是PASMC增殖的重要刺激因子。細胞內鈣離子濃度的變化主要由細胞膜表面不同類型的鈣通道介導,包括電壓依賴性鈣通道(voltage-dependent calcium channels,VDCC)、鈣庫操縱性鈣通道及受體門控性鈣通道等。HIF-1可調節PASMC細胞膜表面鈣通道及鉀通道的活性,引起PASMC細胞膜內外鈣離子和鉀離子濃度的改變,導致PASMC收縮和異常增殖,進而導致HPV和HPVR的發生。

細胞膜去極化是引起VDCC開放的重要因素,電壓門控鉀通道(voltage-gated potassium channel,KV)的表達變化可導致PASMC膜電位的改變。Whitman等[19]研究發現低氧狀態下HIF-1通過促進內皮素(endothelin,ET)-1的表達,導致PASMC中KV1.5、KV2.1的表達減少及細胞內鈣離子濃度的增加,通過ET-1受體抑制劑BQ123治療可削弱上述效應。芹菜素通過抑制HIF-1α-KV1.5途徑,誘導PASMC線粒體依賴性凋亡,從而減輕缺氧誘導的肺動脈高壓的進展[20]。因此,HIF-1可能通過抑制KV的開放,導致鉀離子外流減少,細胞內鉀離子濃度增加,PASMC膜去極化,進一步引起VDCC開放、細胞外鈣離子內流、細胞內鈣離子濃度增加,從而導致肺血管收縮。

鈣庫操縱性鈣通道是由于內質網和肌質網中鈣離子濃度降低而被激活的細胞膜表面的鈣通道。瞬時受體電位通道(transient receptor potential channel,TRPC)是鈣庫操縱性鈣通道的重要組成部分,其中包括TRPC1～7 七個成員[21]。通過抑制TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6能抑制PASMC的增殖,抑制TRPC1可減少PASMC的遷移能力,抑制TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6可促進細胞凋亡,表明TRPC參與了肺動脈高壓過程中PASMC的增殖、遷移及凋亡抵抗過程[22]。BI-749327是一種具有高選擇性的TRPC6拮抗劑,可抑制PASMC中PI3K/Akt/mTOR信號通路,阻斷TRPC6介導的鈣離子內流,從而抑制PASMC的增殖,進而降低肺動脈壓力并部分逆轉肺血管重塑[23]。HIF-1在調節PASMC中TRPC表達和鈣離子穩態方面具有重要作用,HIF-1可促進TRPC的表達,引起細胞外鈣離子內流,導致細胞內鈣離子濃度增加。低氧狀態下,HIF-1可能通過誘導PASMC中骨形態發生蛋白4的表達,通過ERK1/2和p38MAPK信號通路誘導TRPC1、TRPC6的表達增加及細胞內鈣離子濃度增加,參與HPH的發生[24]。

2.3 HIF-1調節肺血管收縮及舒張因子活性

肺血管收縮及舒張因子的平衡失調是肺動脈高壓的特征之一。HPH中HIF-1可調節PAEC分泌的血管收縮及舒張因子的活性,導致血管收縮因子包括ET、5-羥色胺、血管緊張素、血栓素等增加,而血管舒張因子包括一氧化氮(nitric oxide,NO)、前列環素和血管活性腸多肽減少,并通過旁分泌的方式作用于PASMC[25-26]。其中,ET-1和NO二者之間的平衡失調在HPH的發生過程中具有重要作用。HIF-1通過在轉錄水平上誘導下游靶基因ET-1及誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表達,影響了ET-1與NO的平衡,從而導致持續的肺血管收縮。

ET-1通過與ET-1受體結合發揮作用,包括ET-A受體及ET-B受體。ET-A受體主要表達于PASMC,介導PASMC的增殖和血管收縮,而ET-B受體主要位于PAEC,通過釋放NO等血管舒張因子導致血管舒張。ET主要由PAEC產生,通過旁分泌的途徑作用于PASMC[27]。ET-1基因的啟動子區域有HIF-1α的特異性結合位點,低氧可能通過促進HIF-1α產生增多而誘導ET-1基因的表達,使ET-1分泌增加。ET-1亦可通過增加細胞內鈣內流、促進ROS的產生及激活ERK1/2通路等機制,上調大鼠PASMC中HIF-1的合成并下調PHD2介導的HIF-1α的降解,從而促進PASMC中HIF-1的表達[28]。因此,HIF-1和ET-1形成一個雙向調節回路,在肺血管重塑中起重要作用[29]。

NO是PAEC合成及釋放的具有強擴血管作用的內皮源性血管活性因子,iNOS是NO合成過程中的限速酶。低氧狀態下HIF-1表達增多,進而與iNOS基因啟動子區域的相應位點結合,誘導iNOS mRNA的表達,促進NO的合成。當ET-1與PAEC上的ET-B受體結合后,亦可促進PAEC釋放NO,發揮血管舒張作用。然而,當機體長期處于慢性缺氧狀態時,PAEC分泌NO減少,其可能機制包括:(1)大量的ET-1可抑制 HIF-1與iNOS靶基因的特異性位點結合,抑制HIF-1誘導的iNOS mRNA表達,導致PAEC合成NO減少[30]。(2)慢性缺氧可產生大量的ROS,直接損傷PAEC,導致PAEC合成NO減少。以上機制均可導致ET-1與NO之間的平衡失調,引起肺血管收縮,進而導致HPH的發生。

3 針對HIF-1治療HPH的靶點

目前已有多項研究發現,針對HIF-1及其下游信號分子途徑的藥物能降低肺動脈壓力、延緩肺血管及右心室重塑。二氯乙酸是PDK抑制劑,能促進丙酮酸轉化為乙酰輔酶A,抑制糖酵解進而促進糖有氧氧化過程。Li等[31]發現,使用二氯乙酸處理人PASMC可減少HIF-1α的表達,并抑制PDK-1和己糖激酶-2的活性,從而逆轉Warburg效應,導致PASMC的增殖減少和凋亡增加。法舒地爾是選擇性Rho激酶抑制劑,通過法舒地爾抑制PASMC中HIF-1α的表達可顯著抑制缺氧誘導的TRPC1和TRPC6的表達[32],且法舒地爾可抑制HPH大鼠的HIF-1α及ET-1表達,促進NO的表達,延緩右心室重塑,抑制HPH的進展[33]。拓撲替康為拓撲異構酶Ⅰ抑制劑,能抑制HIF-1的轉錄,拓撲替康通過抑制缺氧誘導的大鼠PASMC中HIF-1α、TRPC1、TRPC4、TRPC6的表達和鈣離子內流,從而抑制PASMC的增殖、遷移和收縮合成表型轉換,減輕肺血管重塑和右心室肥厚[34]。Dai等[35]首次發現了針對ET-A受體的免疫療法(包括ETRQβ-002疫苗和針對ETR-002的特異性抗體),該療法可顯著使HPH小鼠右心室收縮壓降低10 mm Hg(1 mm Hg=0.133 3 kPa),有效抑制HPH小鼠的肺小動脈及右心室重塑,降低右心室收縮壓,且不引起肝腎功能損害。

4 結語和展望

HPH是一種嚴重的肺血管疾病。目前臨床上針對HPH的藥物治療主要是通過增強NO和前列環素途徑的信號轉導或減弱ET途徑的信號轉導,恢復血管收縮因子和血管舒張因子的平衡[36],達到擴張肺血管、降低肺動脈壓的目的。雖然擴血管藥物能改善HPH患者癥狀,但不能抑制或延緩肺血管重塑,而肺血管重塑是HPH發展且難以治愈的主要原因,故目前尚不能通過藥物治療治愈HPH。HIF-1是維持細胞氧穩態的關鍵轉錄因子,本文對于HIF-1及其下游信號分子途徑在HPH發生和發展過程中的作用進行綜述,表明HIF-1可通過促進細胞糖代謝模式的轉變,調節細胞膜表面離子通道活性、血管收縮及舒張因子活性等,參與HPH的發生和進展,其機制可能涉及PI3K/Akt/mTOR信號通路的異常激活,但其具體機制仍有待于進一步探究,仍需更多的研究驗證HIF-1及其下游信號分子途徑在HPH患者中的作用機制及治療效果。