基于NF-κB 經(jīng)典信號通路研究黃芩素對高糖誘導(dǎo)HK-2 細胞損傷的保護作用

★ 鄧茜 孫惠力 曾又佳 宋高峰（深圳市中醫(yī)院腎病科 廣東 深圳 518033）

糖尿病腎臟病（diabetic kidney disease，DKD）是導(dǎo)致終末期腎臟病的最常見原因之一，在過去數(shù)十年里由于糖尿病患者增加，其發(fā)病率和患病率也隨之上升，給人類健康帶來嚴(yán)重危害［1］。黃芩素是從黃芩根中分離純化提取的一種黃酮類化合物，實驗研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素可顯著減少糖尿病大鼠腎內(nèi)炎癥介質(zhì)的表達和單核/巨噬細胞浸潤，減少細胞外基質(zhì)，減輕腎小球和腎小管損傷，減少蛋白尿的生成，從而延緩DKD 進程［2］。高血糖是糖尿病最主要的代謝異常，亦是糖尿病腎臟病重要的致病因素。腎小管上皮細胞（HK-2）受各種糖尿病代謝底物高糖等影響，從而分泌促炎癥、促纖維化分子及上皮細胞向充間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，造成腎小管間質(zhì)炎癥、纖維化及腎功能損傷［3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)的HK-2 的毒性損傷具有一定濃度依賴關(guān)系，其機制與NF-κB 通路的激活有關(guān)，與滲透壓作用無明顯關(guān)聯(lián)［4］。NF-κB 信號通路是經(jīng)典炎癥信號通路之一，其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在DKD的病理發(fā)展過程中起著十分重要的作用［5-6］，但其在糖尿病近端腎小管上皮細胞損傷中的作用尚不明確。本研究旨在從細胞水平觀察黃芩素對高糖誘導(dǎo)HK-2 細胞NF-κB 經(jīng)典信號通路關(guān)鍵蛋白（IκBα、p65、p-p65、IKKα）及其下游炎癥分子單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）表達的影響，探討其治療糖尿病腎臟病的作用和機制，為開發(fā)中藥單體成分黃芩素治療糖尿病腎臟病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗細胞

人近端腎小管上皮細胞株（HK-2）購自美國ATCC 公司，貨號CRL-2190TM。

1.2 主要試劑

黃芩素和NF-κB 特異抑制劑PDTC 購自美國Sigma 公司；NF-κB 信號通路關(guān)鍵蛋白抗體試劑盒（IκBα、p65、p-p65、IKKα）、α-tubulin 抗體和HRP 標(biāo)記的二抗均購自美國CST 公司；DEME/F12培養(yǎng)基和DMEM 低糖培養(yǎng)基購自北京賽默飛生物化學(xué)有限公司；胎牛血清購自美國Gibico 公司；BCA 蛋白試劑盒購自美國Pierce 公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的DMEM/F12 完全生長培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃，95%濕度，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱，每周換液2～3 次。當(dāng)細胞生長融合至約80%時，用0.25% Trypsin/0.53% EDTA 溶液消化、傳代。

2.2 主要試劑配制

45 mmol/L 高糖DMEM 培養(yǎng)基：將0.356 g 葡萄糖粉末溶入50 mL 含5.5 mmol/L 葡萄糖 DMEM 培養(yǎng)基中，超凈臺內(nèi)0.22 μmol/L 濾膜過濾除菌，4 ℃存放待用。

黃芩素：超凈臺內(nèi)100 mg 黃芩素溶入3.7 mL DMSO，配制成濃度為0.1 μmol/μL 的原液，室溫避光保存。使用時45 mmol/L 高糖DMEM 培養(yǎng)基稀釋成所需終濃度。

NF-κB 特異抑制劑PDTC：超凈臺內(nèi)16.6 mg PDTC 溶入0.981 mL DMSO，配制成濃度為0.1 μmol/μL的原液，4 ℃避光保存。使用時用45 mmol/L 高糖DMEM 培養(yǎng)基稀釋成100 μmol/L 的終濃度。

2.3 實驗分組

當(dāng)細胞生長融合至約80%時，用DMEM 低糖培養(yǎng)基無血清同步化48 h，然后分組如下：正常糖對照組（5.5 mmol/L 低糖DMEM 培養(yǎng)基，NG）、高糖組（45 mmol/L 高糖DMEM 培養(yǎng)基，HG）、黃芩素低劑量組（25 μmol/L 黃芩素+高糖組）、黃芩素中劑量組（50 μmol/L 黃芩素+高糖組）、黃芩素高劑量組（100 μmol/L 黃芩素+高糖組）、NF-κB 特異抑制劑PDTC 組（100 μmol/L PDTC +高糖組）。

2.4 細胞總蛋白提取

各實驗組干預(yù)24 h，終止培養(yǎng)并收樣：棄去上清液，預(yù)冷PBS 沖洗1 次，加入1×細胞裂解液100～120 μL/皿，冰上靜置10 min，細胞刮反復(fù)刮下細胞，低溫離心機離心，13 500 r/min，10 min，吸取上清液，-80 ℃冰箱保存。

2.5 Western blot 檢測方法

用1×細胞裂解液配平BCA 蛋白定量測得的各樣品蛋白濃度，每孔總上樣量為50～60 μg。電泳：積層膠電壓90 V，待蛋白在積層膠和分離膠交界線壓薄后，換成130 V 電壓至溴酚藍達分離膠底部，結(jié)束電泳。轉(zhuǎn)膜：恒壓100 V，時間120 min。麗春紅染色。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。孵育一抗，4 ℃搖床過夜。室溫孵育二抗1 h。化學(xué)發(fā)光、顯影、定影。在凝膠成像和化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)上掃描和進行灰度分析。每組實驗重復(fù)3 次。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間比較采用完全隨機設(shè)計的單因素方差分析，并進行兩兩比較。應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芩素對高糖誘導(dǎo)的HK-2 細胞NF-κB 通路激活的作用

3.1.1 黃芩素干預(yù)對高糖誘導(dǎo)的HK-2 細胞IκBα蛋白表達的影響 高糖組IκBα蛋白表達下調(diào)，黃芩素中、高劑量組和PDTC 組抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2 細胞IκBα蛋白表達下調(diào)，與高糖組比較差異有顯著性（P＜0.05，P＜0.01）；黃芩素低劑量組與高糖組比較無顯著差異（P＞0.05）。見圖1。

圖1 黃芩素對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞IκBα蛋白表達的影響

3.1.2 黃芩素干預(yù)對高糖誘導(dǎo)的HK-2 細胞p65活化的影響 高糖組p-p65/p65 比值上調(diào)，與正常糖對照組比較有顯著差異（P＜0.01）；黃芩素中、高劑量組和PDTC 組抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2 細胞p-p65/p65 比值上調(diào)，與高糖組比較差異有顯著性（P＜0.05，P＜0.01）；黃芩素低劑量組與高糖組比較無顯著差異（P＞0.05）。見圖2。

圖2 黃芩素對高糖誘導(dǎo)的HK-2 細胞p65活化的影響

3.1.3 黃芩素干預(yù)對高糖誘導(dǎo)的HK-2 細胞IKKα蛋白表達的影響 高糖組IKKα蛋白表達上調(diào)，與正常糖對照組比較有顯著差異（P＜0.01）；黃芩素中、高劑量組能下調(diào)高糖誘導(dǎo)的HK-2 細胞IKKα蛋白表達，與高糖組比較有顯著差異（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3。

圖3 黃芩素對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞IKKα表達的影響

3.2 黃芩素干預(yù)對高糖誘導(dǎo)的HK-2 細胞炎癥分子MCP-1、ICAM-1 表達的影響

高糖組MCP-1、ICAM-1 蛋白表達上調(diào)，與正常糖對照組比較有顯著差異（P＜0.01）；黃芩素中、高劑量組和PDTC 組能下調(diào)高糖誘導(dǎo)的MCP-1、ICAM-1 蛋白表達，與高糖組比較有顯著差異（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4。

圖4 黃芩素對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞MCP-1和ICAM-1蛋白表達的影響

4 討論

DKD 與許多代謝紊亂有關(guān)，如活性氧產(chǎn)生過剩、缺氧狀態(tài)、線粒體功能障礙和炎癥等。現(xiàn)今對糖尿病腎臟病的認識有了很大進步，以腎小球為中心的病理生理學(xué)傳統(tǒng)范式已經(jīng)擴展到小管間質(zhì)、炎癥等，近端小管損傷的生物標(biāo)志物已被證明與DN進展相關(guān)，獨立于傳統(tǒng)的腎小球損傷生物/標(biāo)志物，如蛋白尿等［7］。許多研究已經(jīng)證實炎癥在糖尿病腎臟病的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵的作用，而NF-κB信號通路是炎癥信號的主要傳導(dǎo)通路，包括經(jīng)典NF-κB 信號通路和非經(jīng)典NF-κB 信號通路［8］。本課題組的前期試驗研究表明，黃芩素能夠減輕鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎內(nèi)炎癥進程來延緩糖尿病腎臟病［9］，高糖誘導(dǎo)的HK-2 毒性損傷呈一定的濃度依賴關(guān)系，其機制與NF-κB 通路的激活有關(guān)，與滲透壓作用無明顯關(guān)聯(lián)［4］。本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上，從細胞水平進一步研究黃芩素對高糖誘導(dǎo)HK-2 細胞損傷保護作用及是否與NF-κB 經(jīng)典信號通路關(guān)鍵蛋白（IκBα、p65、p-p65、IKKα）有關(guān)。在哺乳動物中，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 家族包括p65/RelA，c-Rel，RelB，NF-κB（p105/p50） 和NF-κB2（p100/p52）5 種蛋白質(zhì)。p105 和p100 通過蛋白水解作用分別產(chǎn)生p50 和p52。p50 和p52 能與p65/RelA 蛋白形成二聚體復(fù)合物，此復(fù)合物能夠與DNA 結(jié)合及調(diào)節(jié)核因子轉(zhuǎn)錄。正常情況下，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 與其抑制性蛋白IκBα 結(jié)合，以無活性的狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中。NF-κB 激活的中心環(huán)節(jié)是IκBα磷酸化導(dǎo)致IκBα蛋白降解，從而使NF-κB 解離出來。而高分子量IKK 是誘導(dǎo)IκBα磷酸化的主要激酶。IKK由3 個緊密結(jié)合的IKKα、IKKβ、IKKγ 亞基構(gòu)成，IKKα、IKKβ 是IKK 的主要催化亞基。此外，當(dāng)IκBα蛋白降解，p65 與IκBα解離后，p65 磷酸化是NF-κB 轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵；磷酸化的p65 能夠調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的交互作用，具有精確的核定位功能，促進胞漿中的p65 迅速入核，增強轉(zhuǎn)錄活性。研究發(fā)現(xiàn)，TNFα刺激GSK3B 和TBK1 缺乏的細胞能夠正常誘導(dǎo)IκBα磷酸化降解IκBα蛋白，但是不能激活NF-κB。NF-κB 激活能協(xié)調(diào)細胞因子、黏附分子、趨化分子等多種炎癥介質(zhì)的表達。趨化分子MCP-1 和黏附分子ICAM-1 基因啟動子調(diào)控區(qū)內(nèi)有NF-κB 的結(jié)合位點，NF-κB 可與其基因啟動子上κB 序列結(jié)合從而調(diào)節(jié)MCP-1 和ICAM-1的基因轉(zhuǎn)錄。

黃芩素是從黃芩根中提取分離純化的一種黃酮類化合物，具有多種藥理作用，臨床主要用于抗炎、抗病毒。有研究發(fā)現(xiàn)黃芩素對腎小管上皮細胞缺氧復(fù)氧損傷的保護作用［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，50 μmol/L、100 μmol/L 劑量的黃芩素呈劑量依賴性的顯著抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2 細胞IκBα蛋白表達下調(diào)，p-p65/p65 比值和IKKα、MCP-1、ICAM-1 蛋白表達上調(diào)，這表明在高糖誘導(dǎo)的HK-2 細胞損傷中，黃芩素可能通過抑制IKKα介導(dǎo)的IκBα降解和p65 磷酸化，抑制NF-κB 通路激活，從而下調(diào)其下游炎癥分子MCP-1、ICAM-1 的表達，減輕HK-2細胞炎癥損傷。此外，因PDTC 是NF-κB 的特異抑制劑，故在檢測IKKα蛋白表達時未設(shè)PDTC 組。結(jié)果中黃芩素對高糖誘導(dǎo)的NF-κB 下游炎癥分子MCP-1、ICAM-1 的抑制作用強于NF-κB 特異性抑制劑，這可能與黃芩素還可能通過抑制其他與MCP-1、ICAM-1 調(diào)控相關(guān)的信號通路有關(guān)，待進一步研究。

綜上所述，本研究用高糖刺激人近端腎小管上皮細胞株（HK-2）建立糖尿病腎臟病腎小管損傷的體外實驗?zāi)Ｐ停芯堪l(fā)現(xiàn)高糖可以誘導(dǎo)HK-2 細胞IKKα/IκBα/p65 通路激活，并上調(diào)其下游炎癥分子MCP-1、ICAM-1 表達；黃芩素可以通過抑制高糖誘的HK-2 細胞IKKα/IκBα/P65 通路激活，下調(diào)其下游炎癥分子MCP-1、ICAM-1 表達，與本課題的前期實驗結(jié)果一致。提示黃芩素可能通過減輕腎臟細胞炎癥來延緩糖尿病腎病的進展，且與抑制NF-κB 炎癥信號通路的激活密切相關(guān)。