健腦增智飲對AD 細胞模型的神經保護作用及對細胞凋亡的影響

楊玲 翁旭亮 曾婷 王成銀 劉青 邱鈴鈴 雷源

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種起病隱匿的進行性發展的神經系統退行性疾病［1］。臨床上以記憶障礙、計算力下降、理解力下降、失語、失用、失認、視空間技能損害、執行功能障礙及人格和行為改變等全面認知功能下降表現為特征。世界衛生組織報道, 預計到2050 年, AD 患病人數將高達1.52 億, 為目前全球五大死因之一［2］, 給社會和家庭帶來了極大的經濟和社會負擔。隨著人口老齡化現象越來越嚴重,延緩AD 的發展及預防AD 的發生已成為目前關注的焦點問題。AD 的病理特征主要表現為由β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein, Aβ)沉積引起的老年斑(senile plaque, SP)、神經細胞tau 蛋白過度磷酸化引起的神經元纖維纏結(neurofibrillary tangles, NFT)和神經元的丟失［3］。其中Aβ 在腦內異常增多聚集產生神經毒性是AD 的始動與中心環節［4］。健腦增智飲是廣州醫科大學附屬中醫醫院腦病科的科內膏方制劑, 課題組在前期的臨床研究中發現, 其對認知功能障礙有著明顯的改善作用, 可顯著改善認知障礙患者的記憶力、認知功能及日常生活能力, 改善血清S100 蛋白和AchE 指標［5,6］, 但其具體的作用機制尚未開展基礎實驗研究。臨床仍需更進一步的研究以闡明其對AD 認知功能障礙的具體調控機制, 為其進一步的臨床應用提供充分的科學理論依據。本研究擬采用Aβ1-42 構建AD 細胞模型, 通過檢測AD 細胞模型的細胞活性及凋亡水平, 進一步探討健腦增智飲治療AD 的作用機制。

1 材料與方法

1.1 健腦增智飲的制備 健腦增智飲(組方：熟地黃20 g, 茯苓15 g, 巴戟天、山茱萸、石斛、肉蓯蓉、麥冬、石菖蒲、遠志、川芎、丹參、赤芍各10 g, 五味子、生姜、大棗各6 g)復方內含的所有藥材均由廣州醫科大學附屬中醫醫院中藥房提供, 采用自動循環煎藥機提取濃縮, 調整為等滲溶液后按照生物劑量使終濃度為0.5 g/ml, 經過濾除菌后4℃避光保存, 待用前用培養液稀釋至所需濃度。

1.2 細胞培養及分組 將PC12 細胞于90%DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗的培養液中, 置于37℃、95%空氣+5%CO2的培養箱中培養, 1～2 d 更換培養液, 培養至單層細胞匯合后傳代。將對數生長的PC12 細胞,以105個/孔鋪板至6 孔培養板中, 分為六組：①NC組；②AD 組, 加入濃度為20 μmol/L 的Aβ1-42 置培養箱中24 h；③AD+Donepezil 組, 加入20 μmol/L 多奈哌齊(Donepezil)稀釋液預處理PC12 細胞24 h, 再加入20 μmol/L 的Aβ1-42 作用于PC12 細胞24 h；④AD+5 μg/ml 健腦增智飲組、AD+10 μg/ml 健腦增智飲組、AD+20 μg/ml 健腦增智飲組, 應用不同濃度的健腦增智飲(5、10、20 μg/ml)預處理神經細胞24 h, 再加入20 μmol/L 的Aβ1-42 作用于PC12 細胞24 h。

1.3 CCK-8 檢測法檢測細胞活性 96 孔板加入細胞100 μl/孔(約1×104), 置37℃含5%CO2細胞培養箱培養24 h。加入適當濃度的受試化合物。將96 孔板在37℃, 含5%CO2空氣及100%濕度的細胞培養箱中孵育1、2、3 d, 向各孔中加入10 μl 的CCK-8 檢測溶液, 37℃下孵育1 h。讀數前在搖床上混勻, 酶標儀在450 nm 波長處檢測每孔的吸光度。

1.4 western 蛋白印跡法檢測凋亡因子相關蛋白水平 常規流程胰酶消化細胞, 離心, 50 μl RIPA+5 μl PMSF 裂解液裂解各組細胞, 完成總蛋白提取, 按50 體積BCA 試劑加1 體積Cu 試劑(50∶1)配成BCA工作液測定蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳分離, 轉聚偏二氟乙烯(PVDF)膜, 取出雜交膜, TBST 漂洗5 min, 1 次,用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h, TBST 洗膜10 min,1 次, 加合適的一抗稀釋液4℃過夜, TBST 洗膜10 min,3次, 加相應二抗稀釋液37℃孵育1 h, TBST洗膜10 min,3 次, 將雜交膜置于一透明塑料板上, 用一干凈移液器將化學熒光發光底物均勻地加到膜的表面, 并使反應持續5 min, 用試劑盒提供的濾紙吸去膜表面多余的底物溶液, 放至保鮮膜上, 顯影。檢測各組細胞中Bax、Bcl-2 蛋白表達水平。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 取Falcon 試管,并按標本順序編號, 使用冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗細胞2 次, 再用1×Binding Buffer 緩沖液制成1×106細胞/ml的懸液。Falcon 試管中加入100 μl 細胞懸液, 分別加入5 μl Annexin V-FITC與10 μl 碘化丙啶(PI), 充分混勻,室溫(20～25℃)避光處放置15 min。各試驗管中分別加入1×Binding Buffer 緩沖液400 μl。1 h 內用流式細胞儀測定結果。

1.6 統計學方法 采用SPSS22.0 統計學軟件對研究數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示, 采用t 檢驗P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 健腦增智飲對AD 細胞活性的影響 通過CCK-8檢測法測定各組細胞活性結果顯示：與NC 組比較,AD 組活性顯著降低(P＜0.05), 與AD 組比較, AD+Donepezil 組、AD+20 μg/ml 健腦增智飲組細胞活性顯著增高(P＜0.05)。見表1, 圖1。

圖1 不同濃度健腦增智飲對AD 細胞活性的影響

表1 不同時間各組PC12 細胞活性比較( x-±s, n=3)

2.2 健腦增智飲對AD 細胞中Bax、Bcl-2 蛋白表達的影響 通過western 蛋白印跡法測定凋亡因子相關蛋白表達水平結果顯示：與NC 組比較, AD 組Bax 表達水平顯著上調, Bcl-2 水平顯著下調, Bcl-2/Bax 顯著下調(P＜0.05)；與AD 組比較, AD+Donepezil 組、AD+10 μg/ml健腦增智飲組、AD+20 μg/ml 健腦增智飲組Bax 水平顯著下調(P＜0.05), AD+Donepezil 組和AD+20 μg/ml 健腦增智飲組Bcl-2/Bax 顯著上調(P＜0.05)。見表2, 圖2。

圖2 不同濃度健腦增智飲對AD 細胞中Bax、Bcl-2 蛋白表達的影響

表2 不同濃度健腦增智飲對AD 細胞中Bax、Bcl-2 蛋白表達的影響( x-±s, n=3)

2.3 健腦增智飲對AD 細胞凋亡的影響 應用流式細胞儀測定細胞凋亡情況結果顯示：與NC 組比較,AD 組細胞凋亡率顯著升高(P＜0.05)；與AD 組比較,AD+Donepezil 組和AD+5 μg/ml 健腦增智飲組、AD+10 μg/ml 健腦增智飲組、AD+20 μg/ml 健腦增智飲組細胞凋亡顯著降低(P＜0.05)。見表3, 圖3。

圖3 不同濃度健腦增智飲對AD 細胞凋亡的影響

表3 不同濃度健腦增智飲對AD 細胞凋亡的影響( ±s, n=3)

表3 不同濃度健腦增智飲對AD 細胞凋亡的影響( ±s, n=3)

注：與AD 組比較, aP＜0.05

項目NC 組AD 組AD+Donepezil 組AD+健腦增智飲組5 μg/ml10 μg/ml20 μg/ml凋亡率7.870±0.241a36.530±1.42910.690±1.257a26.930±1.790a23.800±1.136a10.410±1.903a

3 討論

關于AD 的治療, 目前臨床尚無特效藥物, 西醫方面主要包括膽堿酯酶抑制劑, 如多奈哌齊(唯一一種同時被美國食品與藥品管理局和英國藥品控制局批準上市的用于對癥治療輕、中度AD 的藥物)、石杉堿甲、加蘭他敏等, 另一類為N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA 受體)拮抗劑, 如美金剛等。盡管目前有多種上市的治療藥物, 但僅能延緩疾病的進展, 而難以治愈及阻止本病的進展, 新的治療策略亟待被發現。

Aβ 是一種由淀粉樣前體蛋白通過γ 分泌酶和β 分泌酶通過剪切而成, 越來越多的研究表明, Aβ在AD 發病機制中起關鍵作用, 是涉及遺傳和環境因素的AD 發病機制的上游分子, 而Aβ 積累及其相關炎癥被認為是AD 腦中神經變性和神經元丟失前的早期事件［4］。研究證實神經元細胞內Aβ 的過度沉積明顯早于臨床癥狀的出現［7］。Aβ 的毒性積聚能夠導致SP 的形成, 引起神經元細胞的死亡、突觸缺失和神經功能的失調, 導致AD 的發生。其中神經元細胞的凋亡是AD 重要的病理改變, 神經元細胞凋亡通路主要包括2 條：線粒體依賴的凋亡通路和死亡受體依賴通路, Aβ 主要通過線粒體通路導致神經元細胞的凋亡, Caspase-3 是凋亡執行的關鍵因子, Aβ 破壞線粒體膜結構, 細胞色素C 釋放至胞質中, 進一步激活caspase-3, 導致細胞凋亡［8］。

本研究以Aβ1-42 誘導PC12 細胞培養成AD 細胞模型, 利用不同濃度健腦增智飲對AD 細胞模型進行干預結果顯示：與NC 組比較, AD 組活性顯著降低(P＜0.05), 與AD 組比較, AD+Donepezil 組增殖活性顯著增高(P＜0.05), AD+20 μg/ml 健腦增智飲組細胞活性亦顯著增高(P＜0.05)。進一步證實健腦增智飲對AD 細胞模型有較好的神經保護作用, 減少AD 細胞的凋亡, 且高濃度(20 μg/ml)健腦增智飲治療AD 組療效更優。上述結果表明, 健腦增智飲可明顯增加細胞活性, 抑制Aβ 蛋白誘導的細胞凋亡, 減少神經元丟失。

Bax 屬于兔抗人單克隆抗體, 是人體最主要的凋亡相關蛋白, Bax 的過度表達可促進線粒體內膜孔道蛋白線粒體膜通透性轉換孔(MPTP)開放, 釋放細胞色素C,激活caspase-9, 進一步激活caspase-3 介導的線粒體凋亡途徑, 促使細胞發生凋亡。而Bcl-2 蛋白是線粒體凋亡的關鍵蛋白, 可阻斷、抑制線粒體內膜孔道蛋白MPTP 開放, 阻斷caspase-3 蛋白激活, 從而阻斷、抑制細胞凋亡。Bax 是與Bcl-2 同源的水溶性相關蛋白, 可拮抗Bcl-2 的保護效應, 促進細胞的凋亡［9-14］。本研究應用western 蛋白印跡法檢測相關凋亡蛋白的表達結果顯示：與NC 組比較, AD 組Bax 表達水平顯著上調, Bcl-2 水平顯著下調, Bcl-2/Bax 顯著下調(P＜0.05)；與AD 組比較, AD+Donepezil 組、AD+10 μg/ml健腦增智飲組、AD+20 μg/ml 健腦增智飲組Bax 水平顯著下調(P＜0.05), AD+Donepezil 組和AD+20 μg/ml 健腦增智飲組Bcl-2/Bax 顯著上調(P＜0.05)。提示AD 組的細胞凋亡增加, 而多奈哌齊和健腦增智飲高濃度可有效減少細胞凋亡的發生, 進一步證實了健腦增智飲通過調控Bcl-2/Bax 的表達對AD 細胞減少細胞的凋亡,起到神經保護作用。

AD 屬于中國傳統醫學“癡呆”范疇, 最早見于東漢《華佗神醫秘傳·華佗治癡呆神方》。殷賀等［15］多名醫家均認為“腎虛、痰、瘀”的基本病機貫穿于AD發生發展的始終。年老腎精虛衰, 腎藏精, 精生髓, 髓源虧乏, 髓海不充, 同時脾胃漸衰, 運化無力, 氣機失調, 濕濁內聚, 郁而成痰, 痰濁內盛, 上蒙清竅, 腦失清靈, 而氣機失調, 氣血瘀滯, 腦絡血脈運行不暢, 瘀血阻滯, 清竅失養, 導致腦神經功能障礙, 發為本病。治療上多以“補腎化痰祛瘀法”貫穿始終［16-19］。基于此基礎, 本課題組成員也總結出治療AD 的經驗方健腦增智飲, 本方以地黃飲子為基礎方加減, 重用熟地黃、山茱萸, 起到以補腎填精益髓為主, 余藥共用, 兼以化痰開竅、活血祛瘀, 標本同治、虛實兼施的作用, 長期應用于臨床, 并取得較好療效。

綜上所述, 健腦增智飲可通過調控Bcl-2/Bax 蛋白的表達, 有效減少AD 細胞的凋亡, 提高細胞的活性,起到對AD 細胞的神經保護作用, 且高濃度(20 μg/ml)健腦增智飲治療組療效更優, 為中醫治療認知障礙疾病的進一步探索提供理論及臨床依據。