外周血循環miRNA表達水平與卵巢癌術后鉑類藥物化療效果及預后的關系研究*

舒 敏 黃秋嬋 王 潔 龍順姬 王伶俐 廣東省深圳市龍華區人民醫院婦科 518109

卵巢癌(Ovary cancer,OC)是女性生殖系統中最常見的一種惡性腫瘤,由于其早期癥狀不明顯,常常造成延誤診斷,使得其病死率高達60%～80%,病死率高居女性生殖系統惡性腫瘤榜首[1]。當前,卵巢癌患者的5年生存率仍然很低,約30%,而導致晚期卵巢癌患者治療失敗的主要原因之一為化療耐藥,尤其是鉑類化療耐藥,超過80%的卵巢上皮性癌患者存在此類情況[2]。對于晚期卵巢癌患者,手術切除和化療是常規的治療方式,但患者的反應和預后卻因個體差異而不同。因此,探索影響卵巢癌化療效果和預后的因素,對個體化治療具有重要意義。據研究表明[3],miRNA在卵巢癌發生和發展中具有重要作用。miRNA是一類長度為20～22個核苷酸的小分子RNA,可以通過與靶基因的mRNA結合從而抑制其翻譯或降解mRNA分子,起到調控基因表達水平的作用。已有研究表明[4],外周血中的一些miRNA可以作為卵巢癌的生物標志物,用于卵巢癌的早期檢測和預后評估。但目前對于外周血循環miRNA與卵巢癌化療效果和預后關系的研究仍不充分,有待進一步探索和驗證。近年來,miRNA作為基因調控分子備受關注,特別是與腫瘤相關的研究。大量研究表明,miRNA在腫瘤的耐藥機制中具有重要作用,因此各種與耐藥相關的miRNA得到了不斷的探究[5]。miRNA存在于腫瘤組織中可以通過多種途徑釋放到血液循環中,而外周血中miRNA具有高度穩定性,因此可成為腫瘤無創診斷、治療反應和預后判斷的生物標志物。本次研究采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time-polymerase chain reaction,RT-PCR)法對卵巢癌術后接受鉑類藥物化療的患者進行外周血檢測,旨在探究化療前后患者外周血循環miRNA的表達水平以及其在化療前后的變化規律和對臨床化療的潛在價值,以期為臨床治療提供借鑒和指導,實現卵巢癌治療的個體化和精準化,總結如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月—2019年12月于我院接受卵巢癌術后鉑類藥物化療的患者50例作為觀察組,同期選擇50例健康體檢者作為對照組。所有納入研究的患者術前進行新輔助化療(Neoadjuvant Chemotherapy,NAC)或晚期,復發化療前后對其外周血標本進行配對,于化療前和化療后2周對患者進行血液采集。在納入的50例患者中,包括子宮內膜樣癌6例,卵巢漿液性癌25例,透明細胞癌5例,黏液性癌14例,其中40例患者進行術前新輔助化療,9例為復發及晚期患者,年齡34～71歲,平均年齡(55.16±12.97)歲?；煼桨赴?順鉑+環磷酰胺、順鉑+紫杉醇、順鉑+阿霉素+環磷酰胺。同時收集50例健康體檢者外周血標本,年齡35～72歲,平均年齡(55.72±12.81)歲。本次研究所有患者均為自愿參與并對研究內容知悉,同時簽署同意書。

1.2 納入及排除標準 納入標準:(1)年齡>30周歲;(2)所有患者經病理檢測確診為卵巢癌;(3)患者臨床資料完整;(4)含順鉑在內的藥物聯合化療>2個療程。排除標準:(1)近期內接受過抗腫瘤治療者;(2)合并自身免疫性疾病者;(3)合并嚴重器質性疾病者;(4)化療不耐受者;(5)合并其他惡性腫瘤者。

1.3 方法

1.3.1 療效評定標準:完全緩解(CR):腫瘤全部消失;部分緩解(PR):腫瘤縮小超過50%;病情穩定(SD):腫瘤縮小<50%或增大<25%;病情惡化(PD):腫瘤增大>50%或出現新的病灶;因疾病或其他因素導致死亡。其中CR、PR表示患者對治療敏感,SD、PD以及死亡表示患者耐藥。

1.3.2 外周血采集:靜脈抽取患者外周血3～5ml,采用EDTA抗凝。將其低溫離心,離心速度為1 200xg,離心10～15min,分離血漿及血細胞,并將血漿和血細胞裝入無RNase的離心管中,分別用1.5ml的離心管進行分裝,并置于-80℃冰箱保存待用。

1.3.3 提取血漿總RNA:將400μl的血漿轉移至新的無RNase的1.5ml EP管中,并在提取總RNA之前進行離心步驟,離心條件為1 200倍重力,溫度為4℃,持續10min。使用美國Ambio mirVana PARIS試劑盒提取總RNA。

1.3.4 逆轉錄:選用德國QIAGEN試劑盒,并嚴格按照操作步驟進行。逆轉錄反應體系配置見表1。將體系混勻后,逆轉錄反應進行前,將其放置在冰上。溫育過程中,溫度應為37℃,時長為60min,用于進行多聚腺苷酸(polyA)加尾及逆轉錄反應。完成反應后,應在95℃下對酶進行失活,然后將其放置在冰上或者儲存在-20℃的冰箱中備用。

表1 逆轉錄反應體系

1.3.5 PCR檢測:miRNA qRT-PCR實驗的步驟如下:首先將miRNA分子末端加上polyA尾,然后使用帶有延伸序列的Olig-dT引物進行逆轉錄,得到cDNA,再使用特異引物進行SYBR Green實時定量PCR擴增,根據表2準備反應混合液,并按照表3設置反應條件,并進行PCR擴增反應,采用2-ΔΔCT方法對數據進行分析。以血漿中的miR-16作為內部參照基因,比較miR-22的表達水平,若miR-22的表達水平比miR-16高1倍以上,則認為miR-22為高表達;如果miR-22的表達水平比miR-16低1倍以下,即為miR-22低表達。

表2 miRNA的qRT-PCR反應體系

表3 反應條件

2 結果

2.1 外周血miRNA表達譜鑒定 采用qRT-PCR檢測2組受試者外周血血漿中miRNA的表達水平,健康體檢者外周血miR-16作為內參對照,共選擇11種miRNA(miR-22、miR-29b、miR-106a、miR-106b、miR-130a、miR-124、miR-145、miR-150、miR-199、miR-142、miR-493),共有6種未檢出,其中miR-22、miR-145、miR-124、miR-142、miR-106a被檢出,且miR-142、miR-22、miR-106a在健康體檢者與卵巢癌患者的外周血表達中具有顯著差異(P<0.05)。

2.2 卵巢癌患者化療前后外周血miRNA表達水平變化及與預后的相關性 分別于化療前及化療2周后采集患者外周血標本,采用qRT-PCR檢測患者miR-22、miR-145、miR-124、miR-142、miR-106a表達水平的變化,檢測得出,只有miR-22在患者進行化療后升高,其他miRNA表達水平變化差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。分析顯示,卵巢癌患者外周血miR-22表達水平與總生存率及無瘤生存率呈正相關(P<0.05)。

表4 miR-22的表達與化療敏感性的關系

3 討論

在卵巢癌進展期患者中,以鉑類一線治療藥物的有效性對患者的預后具有很大影響。因此,如何完善個體化治療方案是提高臨床治療水平的重要方向。近年來,大多研究者對miRNA水平的表達和腫瘤治療反應之間的關系表現出濃厚的興趣。據研究發現[6],miRNA-125b、miRNA-30c、miRNA-130a、let-7e和miRNA-335的表達在卵巢癌耐藥株中存在異常。另有研究顯示[7],miR-199a在化療耐藥中的表達顯著減少,因此可以作為預測卵巢癌耐藥性的有效指標。當前,已有研究者將miRNA表達檢測從腫瘤組織延伸至外周血,因為外周血中miRNA表達穩定且可準確檢測[8]。體外實驗表明,外周血miRNA可以來源于多種途徑,而腫瘤患者血漿miRNA則主要來源于腫瘤組織的大量釋放[9]。大量研究表明,外周血miRNA與腫瘤的發生、發展以及治療反應和預后存在一定的相關性。因此,外周血miRNA可能成為指導腫瘤患者個體化治療的分子標志物[10]。

本次研究篩查了卵巢癌患者的外周血miRNA表達譜,探究健康體檢者和卵巢癌患者在化療前后外周血miRNA的表達變化情況,結果顯示,健康體檢者血漿中miR-106a、miR-22和miR-142的表達量較低,而卵巢癌患者血漿中上述miRNA的表達顯著提高。此結果提示miR-106a、miR-22和miR-142可能在卵巢癌的發生中發揮了作用。此外,通過進一步研究患者接受含順鉑藥物化療前后血漿中miRNA的變化情況顯示,僅有miR-22水平顯著提高,此結果表明,miR-22在卵巢癌患者的外周血中表達增加,化療可影響miR-22的表達量。并且,卵巢癌患者血漿中miR-22水平較高的患者對化療敏感,而較低的患者則表現出對化療的耐受性。此外,在納入研究的50例卵巢癌患者中,通過研究發現其血漿miR-22的表達水平與患者的生存率及無瘤生存率呈正相關。以上結果均證實了外周血miR-22表達水平與卵巢癌患者化療敏感性有密切關聯,可用作預測卵巢癌患者化療敏感性及預后的重要指標。雖然miRNA在血清標本中具有潛在的應用價值,特別是對于早期診斷尚未明確以及晚期無法進行手術的患者,但目前外周血miRNA檢測也存在一些不足之處,如檢測較為煩瑣、費用昂貴,而且對低豐度的miRNA檢測技術還不夠成熟[11]。本文對11種miRNA的表達進行檢測,僅有miR-22、miR-145、miR-124、miR-142、miR-106a被檢出,且豐度均有所差異,因此現有的檢測方法亟須提高靈敏度。

綜上所述,卵巢癌的發生和發展可能與血漿中miR-106a、miR-22、和miR-142的水平升高密切相關。其中,在化療過程中,敏感患者miR-22表達較高,而不敏感患者miR-22表達相對較低,因此,miR-22水平表達能夠作為預測卵巢癌患者化療敏感性及預后的重要指標。