靶向代謝組學技術在肝硬化病情評估和預后判斷中的應用研究*

吳江雷 劉先華 黃 勝

江西省湖口縣人民醫院 1 消化內科 2 檢驗科 332599

肝硬化作為消化系統的慢性疾病,具有較高的發病率,但其起病隱匿,臨床早期可無特異性癥狀以及體征[1]。肝硬化可由各種病因導致免疫系統的慢性損害,臨床上多表現為腹痛、腹瀉、乏力、食欲減退、消化不良等非特異性表現。腸道菌群是一個復雜的生態系統,當腸道菌群失衡時,會損害胃腸黏膜屏障的完整性,導致病菌及其產物進入肝臟,促進炎癥因子的釋放,加劇肝纖維化的發展[2]。從消化內科的發展趨勢來看,腸道靶向微生物標志物可作為肝炎疾病進展的有力診斷工具,靶向代謝組學具有特異性強、定量測序準確、檢測靈敏度高等優點,通過新一代的MS/MS質譜串聯技術,可以更快地實現實時動態監測,同時增強代謝產物的檢測數量[3-4]。但目前的研究大多存在于動物研究中[5],需通過大量的人類樣本研究,為臨床疾病預防提供理論支持。基于此,本研究考慮將靶向代謝組學技術應用于乙型肝炎肝硬化患者的腸道菌群檢測中,探討其對病情評估以及預后判斷的臨床效果,推動消化內科臨床研究水平的發展進步。

1 資料與方法

1.1 一般資料 經我院倫理委員會審批同意后,選取2020年7月—2022年7月于我院確診的81例乙型肝炎肝硬化患者作為研究對象,根據肝硬化的病程發展將其分為代償期組45例與失代償期組36例,另選取同期于我院進行體檢的健康志愿者40例作為對照組。對照組:年齡23～60歲,平均年齡(45.89±7.02)歲,男29例,女11例。代償期組:年齡27～61歲,平均年齡(45.38±7.33)歲,男34例,女11例。失代償期組:年齡28～62歲,平均年齡(46.12±7.52)歲,男27例,女9例。三組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。納入標準:(1)符合乙型肝炎肝硬化診斷標準[6]。(2)年齡18～65歲。(3)近1個月未使用抗生素藥物。(4)近1個月未服用腸道微生態調節劑等胃腸道藥物。(5)對照組志愿者的身體各項檢查正常。(6)患者及家屬均知曉本研究并簽署知情同意書。排除標準:(1)存在除乙型肝炎病毒外的其他病毒、細菌、真菌感染。(2)合并胃腸道疾病者。(3)哺乳期、孕期婦女。(4)存在特殊飲食習慣者,如素食者。(5)合并代謝性疾病患者。(6)合并肝腎功能損害患者。

1.2 方法 代償期組和失代償期患者均接受基礎的抗病毒治療。留取所有受試者治療結束時糞便標本3～5g,置于-80℃冰箱保存待檢;樣本采集過程應避免污染。統一對三組研究人員的糞便樣本進行腸道菌群檢測,根據細菌引物進行擴增,采用Illumina Miseq高通量測序方法進行腸道菌群測序,并提取高質量DNA序列,采用物種分類學和分類單元聚類分析(Operational taxonomic unit,OTU)分析其群落結構和Alpha指數。測量步驟:(1)提取DNA,完成后使用1%瓊脂糖凝膠電泳。(2)使用聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction,PCR)擴增儀(TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase)進行擴增,擴增完成后在2%瓊脂糖中進行電泳檢測。(3)PCR產物熒光定量檢測。(4)Illumina PE250文庫構建。對熒光定量檢測結果進行overlap關系拼接、質控和過濾,完成后進行OTU聚類分析和物種分類學分析。在上述分析的基礎上,再根據菌群豐富度將乙型肝炎肝硬化患者分為高豐度組和低豐度組,對比兩組菌群豐富度與預后發展的相關性。

1.3 觀察指標 (1)菌群分類學組成:對比三組人員腸道內所有菌群的分類學組成[7],門分類包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、酸桿菌門,屬分類包括雙歧桿菌屬、腸桿菌屬、布勞特氏菌屬、瘤胃菌屬、鏈球菌屬。(2)菌群多樣化指數:根據Alpha多樣性反應對比三組人員的腸道菌群情況[8],Chao1指數和ACE指數反映腸道菌群豐富度,Shannon指數和simpson指數反映腸道菌群多樣性,腸道菌群失衡度參數(Cirrhosis dysbiosis index of genus,CDIG):CDIG指數=原籍有益菌群相對豐度(梭菌屬+梭菌屬)/非原籍有害菌屬相對豐度(嗜血桿菌屬+鏈球菌屬+羅斯氏菌屬+韋榮氏球菌屬)。(3)病情進展與腸道菌群的相關性:將三組人員的菌群屬水平與疾病進展進行相關性分析。(4)菌群豐度與預后發展的相關性:將肝硬化患者進行亞分組后,對比高豐度組和低豐度兩組患者的菌群豐度與預后發展的相關性,預后情況根據患者的疾病進展進行評定,代償期乙型肝炎肝硬化分為Ⅰ期和Ⅱ期。失代償期乙型肝炎肝硬化根據生化指標以及病情嚴重程度分為A、B、C三級。兩組患者6個月后通過門診回訪,再次評定患者疾病發展情況,患者進展1級以上或發展為肝癌甚至死亡記為預后不良。預后不良率=(總例數-穩定例數)/總例數×100%。

2 結果

2.1 三組菌群分類學組成比較 門分類中, 三組人員腸道內的主要菌群為厚壁菌門、放線菌門、變形菌門以及擬桿菌門,其中厚壁菌門占比更高;在屬水平上,對照組與兩組肝硬化患者的腸道微生物組成有所不同,兩組肝硬化患者較對照組雙歧桿菌占比有所下降,鏈球菌屬占比上升。詳見表1。

表1 三組菌群分類學組成比較

2.2 三組菌群多樣化指數比較 代償期組與失代償期組患者的豐富度指數Chao1、ACE以及CDIG指數均較對照組降低,且失代償期組降低更明顯(P<0.05),但三組患者的多樣性指數Shannon、simpson差異不明顯(P>0.05)。詳見表2。

表2 三組菌群多樣化指數比較

2.3 病情進展與腸道菌群的相關性分析 病情進展與Chao1、ACE以及CDIG指數呈負相關(P<0.05),與Shannon、simpson指數的無顯著相關性(P>0.05)。詳見表3。

表3 病情進展與腸道菌群的相關性分析

2.4 菌群豐度與預后發展的相關性分析 Kapian-Meier生存曲線分析顯示6個月后高豐度組預后良好效果高于低豐度組[Log Rank(Mantel-Cox)=7.014,P=0.008],詳見圖1。

圖1 菌群豐度與預后發展的相關性分析

3 討論

腸道菌群在生理狀況下可與機體維持平衡狀態,保證人體正常、穩定的代謝、免疫、防御功能,腸道菌群狀況與腸道免疫功能的和平共生關系保障著腸道吸收營養和限制細菌、病毒等通過門靜脈系統進入肝臟的有效作用[9]。生物標志物可以反映機體的生理變化,提示某種特定物質功能或結構上的改變,而其提供的信息可用于早期疾病診斷、療效評價、預后評估中具有重要意義。在消化內科的發展過程中,靶向腸道微生物標志物可稱為病毒性肝炎發展診斷的有力工具。而靶向代謝組學技術作為代謝組學研究的重要組成部分,使得生物標志物的檢測和代謝產物的量性分析成為可能,通過研究生物結構、性質相似的代謝產物,為相關疾病的研究提供高效的解決方法。

本研究發現,腸道內的主要菌群為厚壁菌門、放線菌門、變形菌門及擬桿菌門,其中厚壁菌門占比更高,在屬水平上,對照組與兩組肝硬化患者的腸道微生物組成有所不同,雙歧桿菌在三組中占比最高,但兩組肝硬化患者較對照組占比有所下降,鏈球菌屬占比上升,表示通過靶向代謝組學技術可較直觀地檢測出乙型肝炎肝硬化患者的腸道菌群的種類組成。隨著現代分析技術的發展[10],代謝組學得以快速發展,靶向代謝組學作為其重要組成部分,靶向代謝組學的質譜檢測技術已被廣泛應用于物質檢測中。本研究中采用的串聯質譜檢測可以更容易觀察腸道菌群的差異性,利于對相關毒性菌群的尋找,同時只需對樣本進行簡單的處理,即可直接進行樣本檢測。

本研究利用靶向代謝組學技術對肝硬化患者進行腸道菌群檢測發現,兩組肝硬化患者的豐富度指數Chao1、ACE以及CDIG指數均低于對照組,其中失代償期組降低更加明顯,且疾病進展與Chao1、ACE以、CDIG指數呈正相關,表明腸道菌群可用于肝硬化患者的病情評估。在調節腸壁內外物質運輸過程中,腸道屏障的完整性發揮著重要作用,當腸道菌群失衡時,腸道黏膜屏障受損,病菌及其產物會進入門靜脈系統,最終到達肝臟,激活肝臟免疫系統,釋放促炎細胞因子,加劇肝纖維化的發展[11]。乙型肝炎肝硬化患者的腸道因受到病毒的侵害,導致腸道黏膜屏障不能有效阻止有毒菌群侵害肝臟,導致肝纖維化的進一步發展,加重疾病發展,因此病情越嚴重的患者,腸道菌群豐度就越低,腸道菌群失衡越嚴重。

本研究根據腸道菌群豐度將肝硬化患者進行亞分組后還發現,低豐度組患者的預后不良率高于高豐度組,表示腸道菌群的豐度情況可用于肝硬化患者的預后判斷中。腸道菌群在正常生理狀況菌群豐度較高,肝硬化患者若不能及時糾正腸道菌群的豐富性,則會加重腸道菌群的失衡,導致疾病進展得越快。相關研究在肝衰竭患者的腸道微生物研究中也發現,菌群豐度越低,疾病進展越迅速[12]。在今后的研究中應以腸道菌群失衡治療作為肝硬化患者的研究方向,提供更安全、有效的防治方法,改善患者預后情況。

綜上所述,靶向代謝組學技術揭示了腸道菌群在肝硬化病情評估和預后判斷的有效作用,為臨床選擇生物標志物和預防治療提供了可靠的數據支持。本研究的不足之處在于樣本量較小,且為單中心研究,研究普遍性受限,后期需進行多中心的大樣本研究,進一步驗證本研究結論。