miR-29a通過調(diào)控Plexin-A1抑制膠質(zhì)瘤U87細胞增殖并促進凋亡的機制分析

楊 寒 寧 波

暨南大學(xué)附屬廣州紅十字會醫(yī)院神經(jīng)外科,廣東省廣州市 510220

膠質(zhì)瘤是一種常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)惡性腫瘤,惡性程度非常高,5年生存率不足5%[1]。早期可通過手術(shù)切除,但手術(shù)風(fēng)險大,致殘率高。目前膠質(zhì)瘤發(fā)病機制尚不明確,治療方式存在很大缺陷,嚴(yán)重危害人們的健康。miRNA是一種分子大小約22個核苷酸的非編碼RNA, 研究發(fā)現(xiàn)部分miRNA對腫瘤具有抑制作用[2],miR-29a在腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用,具有靶向治療腫瘤及作為腫瘤診斷標(biāo)記物的潛力[3]。研究發(fā)現(xiàn)miR-29a通過靶向PI3K/AKT/HIF-1α通路的負調(diào)控,減少糖酵解能量供應(yīng),從而抑制膠質(zhì)瘤細胞的生長和增殖,從而增加膠質(zhì)瘤細胞的凋亡[4]。神經(jīng)叢蛋白A1(Plexin-A1)是一種跨膜蛋白受體,參與神經(jīng)細胞傳遞信息、器官發(fā)育、血管生成、腫瘤發(fā)生和免疫調(diào)節(jié)[5]。研究發(fā)現(xiàn)[6]Plexin-A1在腫瘤細胞系中表達升高,且與腫瘤患者預(yù)后相關(guān)。近期的研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤細胞中miR-29a與Plexin-A1存在靶向關(guān)系,但在膠質(zhì)瘤細胞中兩者的關(guān)系尚不明確,本研究擬討論在膠質(zhì)瘤細胞中miR-29a與Plexin-A1的關(guān)系,探究膠質(zhì)瘤的分子機制,以期為治療膠質(zhì)瘤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞和主要試劑 人HEB細胞購自豐暉生物科技有限公司、人U87細胞購自上海美灣生物科技有限公司;miR-29a-3p擬合物和對照擬合物由廣州伯信生物科技有限公司提供。DMEM 培養(yǎng)基購自美國 Gibco公司;Lipofectamine 2000試劑購自美國 Invitrogen公司;總RNA提取試劑盒Magzol購自上海邁跟生物科技有限公司。miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自廣州復(fù)能基因有限公司。CCK-8試劑盒購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。GAPDH和神經(jīng)叢蛋白A1抗體均由深圳市文樂生物科技有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染。人腦正常膠質(zhì)HEB細胞與膠質(zhì)瘤U87細胞分別于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)條件為:溫度37℃、CO2濃度5%。細胞生長至約80%融合度時使用胰酶消化,按1∶3比例傳代,取生長狀態(tài)良好,處于對數(shù)生長期的細胞用于轉(zhuǎn)染或檢測。

1.2.2 qPCR法檢測HEB細胞與U87細胞中miR-29a和神經(jīng)叢蛋白A1 mRNA水平。使用Trizol試劑從HEB細胞與U87細胞中提取總 RNA,將miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性10min;94℃變性10s,60 ℃退火30s,72℃延伸20s,40個循環(huán)。miR-29a相對表達量以U6為內(nèi)參照,引物序列見表1,Plexin-A1以gadph為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法對細胞中 miR-29a和Plexin-A1 mRNA表達水平進行相對定量分析。每個樣本設(shè) 3 個副孔,實驗重復(fù)3次。

表1 引物序列

1.2.3 免疫印跡法檢測HEB細胞與U87細胞中Plexin-A1蛋白的表達。收集細胞,PSB清洗,裂解,提取細胞總蛋白,電泳后轉(zhuǎn)膜。加脫脂奶粉室溫密封2h。使用TBST洗滌,加GAPDH和Plexin-A1一抗(1∶1 000),在4 ℃溫度孵育過夜,加二抗IgG(1∶1 000)后在室溫下孵育21h,顯影、分析、計算。使用 ImageLab 圖像分析軟件,以GAPDH為內(nèi)參計算Plexin-A1蛋白相對表達量。

1.2.4 轉(zhuǎn)染U87細胞。根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染細胞:將膠質(zhì)瘤U87細胞分為3組,對照組不處理,miR-NC組轉(zhuǎn)染陰性mimic,miR-29a組轉(zhuǎn)染miR-29a-3p mimic。

1.2.5 qPCR法檢測轉(zhuǎn)染后U87細胞中miR-29a水平。轉(zhuǎn)染后48h,收集細胞進行實驗,方法與前面相同。若測得對照組與miR-NC組miR-29a水平存在差異,則使用細胞重新轉(zhuǎn)染,若測得對照組與miR-NC組miR-29a水平無差異且miR-29a組miR-29a水平明顯升高,說明轉(zhuǎn)染實驗成功,選取miR-NC組與miR-29a組進行后續(xù)實驗。

1.2.6 CCK8法檢測U87細胞增殖能力。收集轉(zhuǎn)染后的 U87細胞,以每孔104個細胞接種到96孔板中;37℃,5%CO2培養(yǎng)箱,分別于24h、48h、76h和98h每孔加入10μl CCK8溶液,繼續(xù)避光孵育1～2h,終止培養(yǎng);用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測U87細胞凋亡率。收集轉(zhuǎn)染后的 U87細胞接種于6孔板中,接種細胞密度為4×104/ml,每孔接種400μl/孔。在培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后,胰酶消化并離心去掉上清液,輕懸浮細胞后加入AnnexinV/FITC與PI溶液,混合后在室溫下避光孵育5min,使用流式細胞儀進行后續(xù)實驗。

1.2.8 qPCR法和免疫印跡法檢測U87細胞中Plexin-A1 mRNA和蛋白水平。在轉(zhuǎn)染48h后,收集細胞進行實驗,方法同前。

2 結(jié)果

2.1 HEB細胞與U87細胞在miR-29a、Plexin-A1 mRNA及蛋白中的表達差異 實驗結(jié)果顯示,與HEB細胞相比,U87細胞中miR-29a低表達(t=12.54,P<0.001),而Plexin-A1的mRNA(t=3.693,P<0.05)及蛋白(t=4.426,P<0.05)均為高表達,見圖1。說明在膠質(zhì)瘤U87細胞中,miR-29a表達水平較正常膠質(zhì)細胞HEB細胞降低,Plexin-A1表達升高。

圖1 HEB細胞與U87細胞的miR-29a、Plexin-A1 mRNA及蛋白表達差異a. miR-29a表達量 b. Plexin-A1 mRNA表達量 c. Plexin-A1蛋白表達量 d.Plexin-A1蛋白條帶。*表示P<0.05;***表示P<0.001

2.2 miR-29a在U87細胞中的表達 實驗結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染后,miR-29a細胞的miR-29a表達水平較陰性組顯著升高(t=32.23,P<0.001)且miR-NC組miR-29a水平較對照組未改變(t=1.216,P>0.05),說明轉(zhuǎn)染成功,見圖2。

圖2 miR-29a在U87細胞中的表達以及miR-29a對細胞增殖和凋亡的影響a.miR-29a轉(zhuǎn)染后U87細胞中miR-29a的表達差異 b.CCK8實驗檢測細胞增殖能力 c.流式細胞儀檢測細胞凋亡率。ns表示P>0.05;*表示P<0.05;***表示P<0.001

2.3 miR-29a過表達抑制U87細胞增殖,促進凋亡 實驗結(jié)果顯示:與miR-NC組相比,miR-29a的U87細胞增殖能力降低(t= 0.026 3,P<0.05);在48h時,miR-29a的U87細胞的總凋亡率較陰性組增加6.52%(t=3.808,P<0.05),見圖2。實驗結(jié)果說明miR-29a抑制U87細胞增殖并促進凋亡。

2.4 miR-29a抑制U87細胞Plexin-A1的mRNA和蛋白質(zhì)表達 實驗結(jié)果顯示:與陰性對照組相比,miR-29a細胞中Plexin-A1的mRNA(t=4.098,P<0.05)和蛋白質(zhì)表達均降低(t=8.483,P<0.01),見圖3。實驗結(jié)果說明miR-29a抑制了U87細胞Plexin-A1 mRNA和蛋白表達。

圖3 miR-29a抑制U87細胞Plexin-A1的mRNA和蛋白質(zhì)表達a.Plexin-A1 mRNA表達量 b.Plexin-A1 蛋白表達量 c.Plexin-A1蛋白條帶。*表示P<0.05;**表示P<0.01

3 討論

膠質(zhì)瘤是一種常見的中樞神經(jīng)惡性腫瘤,生存率低,惡性程度高,目前臨床上主要的治療方式為手術(shù)聯(lián)合放化療、靶向治療,但手術(shù)切除的局限性、放療的耐藥性和耐透析性導(dǎo)致生存周期短、死亡率高和復(fù)發(fā)率高。因此,研究膠質(zhì)瘤的分子機制對開發(fā)新的膠質(zhì)瘤治療方法具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn),腫瘤的發(fā)生與基因的異常表達相關(guān),降低過表達的促癌基因或升高低表達的抑癌基因,可以抑制腫瘤的進展[7]。目前膠質(zhì)瘤的靶向治療方法十分有限,且治療效果仍然有很大的提升空間。膠質(zhì)瘤的靶向治療主要有兩個方面,一方面是通過抑制血管生成,主要藥物是貝伐珠單抗[8];另一方面是通過抑制表皮生長因子受體達到治療效果,主要藥物有西妥昔單抗[9]、尼妥珠單抗[10]以及小分子酪氨酸激酶抑制劑如吉非替尼[11]。較肺癌和乳腺癌等其他惡性腫瘤相比,膠質(zhì)瘤的靶向治療效果較差,這些藥物在一線治療中均未表現(xiàn)出較滿意的療效。

miRNA是一種小分子非編碼RNA,不編碼蛋白質(zhì),但在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。miRNAs[12]已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有抑制膠質(zhì)瘤的作用,具有靶向治療膠質(zhì)瘤的潛力,恢復(fù)抑癌miRNA的表達可以抑制腫瘤的進展。因此,研究miRNA和miRNA的作用靶點具有重要意義。

本研究對miR-29a在膠質(zhì)瘤中的表達進行了分析,證明上調(diào)miR-29a可以降低Plexin-A1的表達,從而抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖,促進凋亡,從而抑制膠質(zhì)瘤的進展。本研究初步驗證了miR-29a在膠質(zhì)瘤U87細胞中低表達,Plexin-A1高表達。同樣,miR-29a已被證明在肺癌細胞系中下調(diào)膠原蛋白抑制肺癌轉(zhuǎn)移[13],還有研究發(fā)現(xiàn)miR-29a-3p可以通過下調(diào)C1QTNF6降低肺腺癌細胞的遷移率和增殖能力,降低肺腺癌細胞的遷移和侵襲可能性[14];miR-29a-3p通過靶向和抑制AMDM12增強口腔鱗狀細胞癌細胞的放射敏感性[15]。由于miR-29a-3p低表達明顯與子宮內(nèi)膜癌患者低分化、未分化、FIGO晚期、重度肌肉浸潤、淋巴轉(zhuǎn)移陽性均相關(guān),因此miR-29a-3p的降低可能作為不良生存的獨立預(yù)測因子[16]。在本研究中,通過miRna下游靶基因預(yù)測,發(fā)現(xiàn)Plexin-A1可能是miR-29a的直接靶點。

Plexin-A1是信號家族受體之一,它是一種單通路的膜結(jié)合信號素,最初被認(rèn)為是軸突引導(dǎo)因子。在生理狀態(tài)下,Plexin-A1作為細胞表面受體,與配體結(jié)合后,向細胞內(nèi)傳導(dǎo)信息,調(diào)節(jié)細胞的生長凋亡和血管生成等。腫瘤發(fā)生時常存在細胞惡性表型的獲得、原癌基因的異常表達、細胞生長信號通路的異常激活、血管的異常生成。在腫瘤中,Plexin-A1異常表達,介導(dǎo)肺癌細胞自分泌SEMA3A信號誘導(dǎo)的惡性表型的獲得[17],且異常地激活了食管癌細胞中的MAPK信號通路[18]。另外,Plexin-A1可促進血管形成,在膠質(zhì)瘤的體內(nèi)外實驗中觀察到了同樣的結(jié)果,在血管內(nèi)皮細胞中Plexin-A1促進JAK2-STAT3表達,進一步促進血管生成[6]。在膠質(zhì)瘤的靶向治療中,針對腫瘤的血管生成是一種可靠的方式,因此,Plexin-A1可能是一個十分有效的靶點。筆者推測miR-29a下調(diào)Plexin-A1后,可能進一步影響了膠質(zhì)瘤的異常生長和信號通路的異常激活,以及血管的生長,從而多方面對膠質(zhì)瘤的發(fā)展產(chǎn)生抑制作用。

針對膠質(zhì)瘤的靶向治療有很大的局限性,本實驗首次在膠質(zhì)瘤U87細胞中驗證了miR-29a與Plexin-A1的關(guān)系,為開發(fā)膠質(zhì)瘤的靶向治療提供新思路。本實驗的不足之處在于僅在細胞水平驗證了一種膠質(zhì)瘤細胞中的miR-29a和Plexin-A1的表達水平和作用關(guān)系,后續(xù)需在其他多種細胞系及動物體內(nèi)實驗中進一步驗證,miR-29a降低Plexin-A1的表達水平對下游分子的影響尚未驗證,miR-29a在膠質(zhì)瘤中可能存在更多的靶基因,miR-29a的作用需進一步研究。

綜上所述,在膠質(zhì)瘤U87細胞中miR-29a低表達,miR-29a抑制U87細胞增殖、遷移和侵襲,同時抑制Plexin-A1的表達,miR-29a在膠質(zhì)瘤U87細胞中可能通過抑制Plexin-A1的表達發(fā)揮抑癌作用。這為開發(fā)基于miRNA靶向治療膠質(zhì)瘤的研究提供了理論依據(jù)。