基于UPLC-QE-HF-MS/MS技術分析紅涼傘化學成分及入血成分 Δ

石 慧 ，李 曉 周 英 丁晶鑫 劉 暢 劉雄偉 董 秀 ，陳 贇 俸婷婷 （.貴州中醫藥大學藥學院，貴陽 55005；.貴州中醫藥大學藥食兩用資源應用與開發研究中心，貴陽 55005；3.貴州中醫藥大學納米藥物技術研究中心，貴陽 55005；.貴州三力制藥股份有限公司，貴州 安順 5600）

紅涼傘是紫金牛科紫金牛屬植物紅涼傘Ardisia crenataSims var.bicolor（Walk）C.Y.Wu et C.Chen 的干燥根及根莖，是壯族、瑤族常用民間草藥[1—2]。紅涼傘具有祛風除濕、清熱解毒、止咳平喘等功效，常用于治療跌打損傷、關節疼痛、扁桃體炎、咽喉腫痛、腰背痛等[3—4]。紅涼傘中主要化學成分有三萜皂苷類、黃酮類、香豆素類和酚酸類等多種成分[5—6]，現代藥理學研究表明其具有抗病毒、抗腫瘤、防治心腦血管疾病及抑制乳腺癌轉移等作用[7—8]。但紅涼傘治療疾病的藥效物質基礎尚不明確，且關于紅涼傘的化學成分研究較少。基于中藥血清藥物化學理論，中藥真正發揮功效的活性成分與其所含的固有成分往往不同，只有從血中發現直接作用的活性物質并追溯其前體化合物才能真正闡明中藥發揮臨床療效的藥效物質基礎[9]。因此，本研究采用可以高效、快速得到目標分析物的分子離子峰和碎片離子等信息的超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜法（UPLC-QE-HF-MS/MS）對紅涼傘的化學成分進行分析，同時依據中藥血清藥物化學理論對其入血成分進行分析，以期為紅涼傘藥效物質基礎研究提供參考，為建立科學的用藥依據和質量控制方法提供依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Thermo Vanquish 型超高效液相色譜儀、Thermo Q-Exactive HF/MS 四極桿串聯高分辨質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），JP2-160型萬分之一電子天平（日本Chyo公司），XS205型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司），SB-600DTY 型超聲波清洗器（寧波新芝生科技股份有限公司），MTN-2800D 型氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

紅涼傘藥材于2019年10月采集于貴州省凱里市雷山縣雷公山，并經貴州中醫藥大學藥學院魏升華教授鑒定為紫金牛科紫金牛屬紅涼傘A.crenataSims var.bicolor（Walk）C.Y.Wu et C.Chen 的干燥根及根莖。對照品巖白菜素（批號PS000991）、朱砂根皂苷A（批號PS011516）、丁香酸（批號D-019-180426）均購于成都瑞芬思生物科技有限公司，純度均≥98%；甲醇、乙腈、甲酸為質譜級，水為超純水。

1.3 動物

本研究所用動物為健康雄性清潔級SD 大鼠，共12只，體重（200±20） g，購于長沙市天勤生物技術有限公司，動物生產許可證號為SCXK（湘）2019-0014。本研究動物實驗符合貴州中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查批準要求（批準號為20210169）。

2 方法

2.1 紅涼傘提取物的制備

稱取紅涼傘藥材250 g，加10 倍量水（mL/g）煎煮2次，每次2 h，趁熱過濾，合并濾液。將濾液經旋轉蒸發儀濃縮，真空干燥備用，得率為33.90%。

2.2 供試品溶液的制備

取相當于0.2 g 生藥材質量的提取物細粉，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定質量；超聲（功率180 W，頻率40 kHz）處理40 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，收集續濾液。精密量取續濾液5 mL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜至進樣杯中，供UPLC-QE-HF-MS/MS分析。

2.3 對照品溶液的配制

精密稱取巖白菜素、朱砂根皂苷A、丁香酸對照品約10 mg分別至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得質量濃度為1 mg/mL 的儲備液。分別精密量取上述對照品儲備液各500 μL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，得混合對照品溶液。

2.4 分組、給藥及取材

大鼠適應性喂養1 周后，采用配對比較法將其隨機分為空白組和紅涼傘給藥組，每組6只。實驗期間，空白組大鼠自由攝食飲水，給藥組大鼠灌胃“2.1”項下制備的提取物（生藥質量濃度為0.5 g/mL），給藥劑量為5 g/kg（約等于10倍成人臨床等效劑量），每天上、下午各給藥1次，連續3 d。第4天上午再次給藥1 h后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（2.25 mL/kg）對大鼠進行麻醉。腹主動脈取血，靜置30 min，低溫、低速離心（4 ℃，4 000 r/min，15 min），收集上清液，立刻凍存于－80 ℃冰箱中，供后續處理分析。

2.5 血清樣品處理

取空白組和紅涼傘給藥組大鼠血清各200 μL，分別加入3 倍量甲醇，渦旋混勻，在4 ℃下以10 000 r/min 離心15 min，取上清液至EP管中，以37 ℃氮氣吹干。殘渣加入100 μL 甲醇復溶，渦旋2 min，溶解，在4 ℃下以14 000 r/min 離心15 min，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，即得待測血清樣品。

光敏電阻，是利用半導體的光電效應制成的一種電阻，其阻值隨入射光的強弱而改變，具有以下特點：光譜響應寬；測試光強范圍寬，即可對強光響應，也可對弱光響應；無極性區分，使用方便，成本低，壽命長；靈敏度高，工作電流大，可達數毫安[2]。

2.6 檢測條件

2.6.1 色譜條件

采用Agilent Zorbax Eclipse C18色譜柱（100 mm×2.1 mm×1.8 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，5%A；2～7 min，5%A→30%A；7～12 min，30%A→78%A；12～14 min，78%A；14～18 min，78%A→95%A）；柱溫為30 ℃；流速為0.3 mL/min；進樣量為2 μL；自動進樣器溫度為4 ℃。

2.6.2 質譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），在正、負離子模式下檢測；加熱器溫度為325 ℃；鞘氣壓力為45 arb，輔助氣壓力為15 arb，吹掃氣壓力為1 arb；電噴霧電壓為3.5 kV；毛細管溫度為330 ℃；S-Lens RF Level 為55；掃描模式為一級全掃描（full scan，m/z100→1 500）與數據依賴性二級質譜掃描（dd-MS2，Top N＝10）；分辨率為70 000（一級質譜）、17 500（二級質譜）；碰撞模式為高能量碰撞解離模式。

2.7 紅涼傘化學成分及入血成分分析

取紅涼傘供試品溶液、含藥血清樣品、空白血清樣品，按“2.6”項下條件進行UPLC-QE-HF-MS/MS 分析，記錄圖譜信息。使用Compound Discoverer 3.0 軟件進行保留時間矯正、峰識別、峰提取等工作，根據二級質譜信息，利用Thermo mzCloud 在線數據庫、Thermo mz-Vault 本地數據庫，并參照有關文獻和對照品質譜信息，初步鑒定紅涼傘化學成分及入血成分。

3 結果

3.1 紅涼傘提取物化學成分鑒定

對紅涼傘樣品的質譜數據進行分析可知，從紅涼傘提取物中共鑒定出34個化合物，其中包括香豆素類化合物4個、黃酮類化合物5個、黃酮苷類化合物1個、有機酸類化合物3個、酯類化合物4個、酚類化合物3個、皂苷類化合物2個、氨基酸類化合物3個、脂肪酸類化合物3個、其他類化合物6 個，詳見表1。紅涼傘樣品的總離子流圖見圖1。

表1 紅涼傘提取物中化學成分鑒定結果

圖1 正、負離子模式下紅涼傘提取物的總離子流圖

3.2 主要化合物結構解析

本研究以化合物8為例進行鑒定分析。在負離子模式下，化合物8的保留時間為4.556 min，準分子離子峰為m/z327.072 2[M－H]－，分子式為C14H16O9。二級質譜信息中，首先，母離子丟失1分子－CH2O，得到碎片離子m/z297.332 8[M－H－OCH2]－，進一步丟失1分子－CH2OH和1分子－OH，得到碎片離子m/z249.040 2[M－HOCH2－CH2OH－OH]－，再丟失2分子H2O，得到碎片離子m/z213.936 7[M－H－OCH2－CH2OH－OH－2H2O]－；或者在丟失1分子－CH2O的基礎上，丟失1分子－CH2OH和1分子－CHO，得到碎片離子m/z237.039 5[M－HOCH2－CH2OH－CHO]－，進一步丟失1分子CO2，得到碎片離子m/z193.013 4[M－H－OCH2－CH2OH－CHOCO2]－。其中，最強的碎片離子峰是母離子丟失1分子－C4H8O4得到碎片離子m/z207.029 3[M－H－C4H8O4]－，進一步丟失1分子－CH3得到碎片離子m/z192.005 9[M－H－C4H8O4－CH3]－，再通過內酯環裂解與氫位移，得到碎片離子m/z154.388 5[M－H－C4H8O4－CH3－C2O+H]－。根據碎片信息、對照品比對及文獻報道[10]，推測該化合物為巖白菜素，其可能裂解途徑見圖2。

圖2 巖白菜素的質譜裂解途徑

3.2.2 黃酮及其苷類化合物的鑒定

本研究從紅涼傘提取物中共鑒定了6個黃酮及其苷類化合物，主要結構類型為黃酮醇類及糖苷類等，本研究分別以化合物19和化合物14為例進行鑒定分析。

在負離子模式下，化合物19 的保留時間為6.663 min，準分子離子峰為m/z301.035 4[M－H]－，分子式為C15H10O7。母離子分別通過黃酮類化合物的2 種經典裂解途徑——RDA裂解和裂解途徑Ⅱ裂解，得到碎片離子m/z151.002 8[M－H－C8H6O3]－和m/z107.012 6[MH－C9H6O5]－，其均為黃酮類化合物的特征碎片離子。準分子離子峰m/z301.035 4[M－H]－再丟失1分子－C8H3O5得到碎片離子m/z121.028 4[M－H－C8H3O5]－。根據碎片離子信息及文獻報道[11]，推測該化合物為黃酮類化合物槲皮素，其可能裂解途徑見圖3。

圖3 槲皮素的質譜裂解途徑

在正離子模式下，化合物14 的保留時間為5.840 min，準分子離子峰為m/z611.160 7[M+H]+，分子式為C27H30O16。母離子首先丟失1 分子鼠李糖（Rha）得到碎片離子m/z465.102 5[M+H－Rha]+，再丟失1分子葡萄糖（Glc）生成m/z303.049 6[M+H－Rha－Glc]+，再進一步丟失1 分子－CO 和2 分子－OH 獲得碎片離子m/z242.102 1[M+H－Rha－Glc－CO－2OH]+。根據碎片信息及文獻報道[12]，推測其為黃酮苷類化合物槲皮素3-O-鼠李糖苷-7-O-葡萄糖苷，其可能的裂解途徑見圖4。

圖4 槲皮素3-O-鼠李糖苷-7-O-葡萄糖苷的質譜裂解途徑

3.2.3 有機酸類化合物的鑒定

在紅涼傘提取物中找到較多有機酸類化合物，此類化合物結構相對簡單，多為苯環連接－OH、－OCH3、－COOH等基團。

本研究以化合物7為例進行鑒定分析。在正離子模式下，化合物7 的保留時間為4.547 min，準分子離子峰為m/z199.060 0[M+H]+，分子式為C9H10O5。母離子脫去1分子H2O生成碎片離子m/z181.049 4[M+H－H2O]+；或者失去1 分子CO2獲得碎片離子m/z155.070 1[M+HCO2]+，在此基礎上再失去1分子－CH3獲得碎片離子m/z140.046 7[M+H－CO2－CH3]+，繼續丟失1 分子－OH 獲得m/z123.044 2[M+H－CO2－CH3－OH]+，再丟失1 分子－CO生成碎片離子m/z95.049 6[M+H－CO2－CH3－OH－CO]+。根據碎片離子信息、對照品比對及文獻報道[8]，推測該化合物為丁香酸，其可能裂解途徑見圖5。

圖5 丁香酸的質譜裂解途徑

3.3 紅涼傘入血成分鑒定

本研究首先通過空白血清扣除大鼠血液中物質對藥材入血成分分析的影響，然后通過對比含藥血清、空白血清以及紅涼傘藥材提取物的質譜信息，根據色譜峰保留時間、質譜裂解規律及與對照品的比較，共鑒定出5個入血成分，分別為L-焦谷氨酸、丁香酸、巖白菜素、朱砂根皂苷A、麥考酚酸，詳見表2。正、負離子模式下大鼠空白血清及含藥血清的總離子流圖見圖6。

表2 紅涼傘提取物入血成分鑒定結果

圖6 正、負離子模式下大鼠空白血清及含藥血清的總離子流圖

3.4 對照品驗證

在紅涼傘提取物的化學成分及入血成分中，巖白菜素、丁香酸和朱砂根皂苷A這3個成分均有檢出。因此，本研究選擇巖白菜素、丁香酸和朱砂根皂苷A的對照品進行化合物驗證。將紅涼傘提取物中這3個成分的二級質譜圖與各相應對照品的二級質譜圖進行鏡像比對，發現兩者的碎片離子大量重合，基本可以確定為同一化合物，驗證了本研究數據的準確性。本研究以巖白菜素的二級質譜圖為例進行結果展示，詳見圖7。

圖7 巖白菜素二級質譜圖比對鏡像圖

4 討論

本研究采用UPLC-QE-HF-MS 技術結合中藥血清藥物化學理論，鑒定出了紅涼傘提取物中的34個化學成分，并鑒定出5個原型入血成分，分別為L-焦谷氨酸、丁香酸、巖白菜素、朱砂根皂苷A、麥考酚酸。紅涼傘的化學成分及入血成分主要為香豆素類、黃酮類、酚酸類及皂苷類成分。其中，巖白菜素為香豆素類化合物，具有抗炎鎮痛、抗心律失常、抗腫瘤、抗氧化、促進睡眠等作用，同時其對呼吸系統、消化系統、免疫系統有一定影響[13]；丁香酸具有治療白內障的作用[14]；麥考酚酸是有機酸類物質，具有抗腫瘤、抗癌、抗炎等作用[15—16]；朱砂根皂苷A 等三萜皂苷類化合物具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、增強免疫等藥理作用[17]；L-焦谷氨酸及其衍生物具有較好的抑菌、抗氧化及抗炎作用[18]。

綜上所述，L-焦谷氨酸、丁香酸、巖白菜素、朱砂根皂苷A 及麥考酚酸可以初步推測為紅涼傘的藥效物質基礎，為后續研究奠定了基礎。但中藥化學成分復雜，部分化合物響應值較低，本研究檢測及鑒定出的成分并不完全，研究結果具有一定局限性，后續還需進行深入研究。