黃芩湯的抗須癬毛癬菌活性及作用機制研究 Δ

沈成英 ，羅 忠 ，章 佩 ，鄧馮沂 ，申寶德 ，胡建新 [.江西省人民醫院（南昌醫學院第一附屬醫院）藥學部，南昌 0006；.南昌大學藥學院，南昌 0006；.江西省人民醫院（南昌醫學院第一附屬醫院）臨床醫學研究所，南昌 0006；.江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室，南昌 000]

皮膚癬菌病是皮膚癬菌侵犯人和動物的皮膚、毛發、甲板等所引起的一類疾病，根據發病部位可以分為頭癬、體癬、手癬、甲癬等。頭癬表現多樣，嚴重者可造成永久性脫發。甲癬可表現為指甲肥厚、變色、渾濁等，其他皮膚癬菌病多表現為瘙癢性皮疹。世界上有20%～25%的人受到其影響，特別是老年人、糖尿病患者或免疫缺陷者[1]。近年來，因真菌耐藥性不斷增強，皮膚癬菌病的發病率也在逐年上升。目前用于治療該病的藥物種類有限，主要為傳統的抗真菌藥物，包括唑類、三唑類、烯丙胺類等[2]。然而，這些藥物由于治療時間長、副作用大且耐藥性強，其臨床應用受到一定限制[3]。

中藥具有療效好、來源廣泛、不良反應少、耐藥性弱等優勢，為研發天然抗真菌藥物提供了寶貴資源。黃芩湯（Huangqin decoction，HQD）首載于張仲景的《傷寒論》，由黃芩、白芍、炙甘草、大棗組成，具有清熱止痢、和中止痛的作用[4]?，F代藥理研究表明，HQD 具有抗菌、抗炎、解熱、鎮痛、解痙等作用[5—6]。本課題組前期研究發現，HQD對臨床分離的常見皮膚癬菌具有抑制作用，其最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）為1.75～5.90 mg/mL[7]，但具體作用機制尚不明確?；诖耍狙芯恳皂毎_毛癬菌為模型菌株，考察HQD對該菌的菌絲生長、孢子萌發和生物量等的影響，并探討其作用機制，為HQD治療皮膚癬菌病提供理論基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有XS105DU型十萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo 公司）、Multiskan FC 型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）、LC-2010A 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）、SPX-25085H-Ⅱ型生化培養箱（上海新苗醫療器械制造有限公司）、HC-2517型高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）、NP80型紫外分光光度計（德國Implen公司）、JEM1200型透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）。

1.2 主要藥品與試劑

黃芩、白芍、炙甘草、大棗飲片購自江西彭氏國藥堂飲片有限公司，經江西省人民醫院藥學部胡建新主任藥師鑒定，分別為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi.的干燥根、毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根、豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖以及鼠李科植物棗Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果實。葡萄糖、吐溫-20、山梨醇購自上海生工生物工程股份有限公司；蛋白胨購自北京奧博星生物技術有限責任公司；麥角固醇（純度＞98%，批號HR20525B1）購自寶雞辰光生物科技有限公司；氯霉素、特比萘芬（terbinafine，TBF）、咪康唑（miconazole，MCZ）、兩性霉素B （amphotericin B，AMB）、卡泊芬凈（caspofungin，CAS）（純度均大于98%，批號分別為829J047、713T011、623M012、715V036、420O021）均購自北京索萊寶科技有限公司；RPMI-1640 培養基（批號2496521）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；角鯊烯環氧酶（squalene epoxidase，SE）、羊毛甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）試劑盒（批號分別為YX-190500、YX-032516）均購自上海優選生物科技有限公司；蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）和鈉鉀ATP酶、鈣鎂ATP酶、總ATP 酶試劑盒（批號分別為A021-2-1、A022-1-1、A070-6-1）均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 菌株

須癬毛癬菌臨床分離株由國家衛生健康委員會真菌病監測網江西分中心暨江西省人民醫院臨床醫學研究所分離鑒定并保存。

2 方法與結果

2.1 HQD的制備

按照文獻[8]方法制備HQD：取黃芩、白芍、炙甘草和大棗按照3∶2∶2∶2的比例稱取適量，加10倍量（mL/g，下同）水，煎煮1 h，趁熱過濾；藥渣加8 倍量水繼續煎煮1 h，過濾藥液；合并2 次藥液，濃縮成每毫升含1 g 生藥的藥液，經冷凍干燥后保存備用。

2.2 HQD的抗菌活性評價

2.2.1 MIC和最小殺菌濃度的測定

參照美國臨床和實驗室標準協會的《絲狀真菌肉湯稀釋抗真菌藥敏試驗的參考方法》（M38-3rd）配制須癬毛癬菌終濃度為（1～5）×104cfu/mL 的菌懸液，備用。取96孔板，每孔均加入100 μL RPMI 1640培養基，然后向第1 孔中加入 200 mg/mL HQD 100 μL，用移液槍混勻后吸取100 μL至第2孔，如法依次進行2倍稀釋至第10 孔，使各孔中HQD 的終濃度分別為100、50、25、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20 mg/mL。向第1～10、12孔中加入配制好的菌懸液100 μL，以第11孔為陰性對照，第12孔為陽性對照。AMB（0.031 25～16 μg/mL）、TBF（0.003 9～2 μg/mL）、MCZ（0.39～200 μg/mL）、CAS（0.39～200 μg/mL）為陽性對照藥物。將上述96孔板置于生化培養箱中，以28 ℃培養4 d，肉眼觀察各孔真菌的生長情況，并與陽性、陰性對照孔比較，以肉眼觀察到無真菌生長的最低藥物質量濃度為MIC 值。結果顯示，HQD、AMB、TBF、MCZ、CAS 的MIC 值分別為3.13 mg/mL、1 μg/mL、0.062 5 μg/mL、6.25 μg/mL、50 μg/mL。上述藥敏實驗結束后，吸取HQD各給藥組的內容物200μL 至沙氏葡萄糖瓊脂培養基（Sabouraud dextrose agar，SDA）培養板上培養7 d，以不長菌落的最低藥物質量濃度為最小殺菌濃度（minimal fungicidal concentration，MFC）。結果顯示，HQD的MFC值為25 mg/mL。

2.2.2 HQD對須癬毛癬菌菌絲生長的影響

參照文獻[9]方法測定HQD對須癬毛癬菌菌絲生長的影響。實驗分為陰性對照組、TBF組（0.062 5 μg/mL，劑量根據“2.2.1”項下結果設置）和HQD 低、中、高劑量組（1.56、3.13、6.25 mg/mL，劑量根據“2.2.1”項下結果設置）。將須癬毛癬菌接種在SDA 培養板上，培養一段時間后，用直徑為9 mm 的打孔器取菌塊作為菌餅備用。取不同質量濃度的HQD與預熱的SDA培養基混合均勻后倒入直徑為9 cm的無菌培養皿中制備含藥培養基，在此培養皿中用9 mm的打孔器除去中間培養基并接種上述9 mm 的菌餅，用封口膜密封培養皿，置于28 ℃培養箱中培養6 d，采用十字交叉法測量菌絲長度。菌絲長度（mm）＝菌絲長度測量平均值－9。實驗重復3次。采用SPSS 21.0 軟件對數據進行統計分析，數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α＝0.05（下同）。由表1 可知，與陰性對照組相比，TBF 組和HQD 各劑量組須癬毛癬菌菌絲長度均顯著縮短（P＜0.05），且TBF 組和HQD 高劑量組須癬毛癬菌菌絲長度顯著短于HQD低劑量組（P＜0.05）。

表1 各組須癬毛癬菌菌絲長度、孢子萌發率、生物量的檢測結果（±s，n＝3）

表1 各組須癬毛癬菌菌絲長度、孢子萌發率、生物量的檢測結果（±s，n＝3）

a：與陰性對照組比較，P＜0.05；b：與HQD低劑量組比較，P＜0.05；c：與HQD中劑量組比較，P＜0.05。

組別陰性對照組TBF組HQD低劑量組HQD中劑量組HQD高劑量組菌絲長度/mm 15.25±1.00 12.29±0.38ab 13.67±0.44a 12.63±0.78a 11.33±0.80ab孢子萌發率/%89.33±8.08 30.00±6.00ab 44.00±6.00a 26.00±6.00ab 18.67±7.02abc生物量/mg 21.55±3.80 10.95±3.21a 15.88±1.94a 13.33±3.28a 10.43±1.91ab

2.2.3 HQD對須癬毛癬菌孢子萌發的影響

實驗分為陰性對照組、TBF 組（0.062 5 μg/mL）和HQD 低、中、高劑量組（1.56、3.13、6.25 mg/mL），將相應藥液與須癬毛癬菌菌懸液（5.0×105cfu/mL）充分振蕩混合均勻后，接種于含有SDA的凹玻片上，置于濕盒中，于28 ℃培養24 h。采用顯微鏡觀察孢子萌發情況（以抽出芽管、長出菌絲為萌發），計算每100個孢子中萌發的孢子數，孢子萌發率＝發芽孢子數/檢查孢子總數×100%[10]。實驗重復3 次。由表1 可知，與陰性對照組相比，TBF 組和HQD 各劑量組須癬毛癬菌孢子萌發率均顯著降低（P＜0.05），且HQD的抑制作用呈劑量依賴性。

2.2.4 HQD對須癬毛癬菌生物量的影響

實驗分為陰性對照組、TBF 組（0.062 5 μg/mL）和HQD 低、中、高劑量組（1.56、3.13、6.25 mg/mL）。取無菌搖菌管，加入5 mL 含藥沙氏葡萄糖液體培養基（Sabouraud dextrose broth，SDB）和1 mL 含有5.0×105cfu/mL 的須癬毛癬菌菌懸液，用封口膜密封搖菌管，在28 ℃條件下以120 r/min 振蕩6 d；過濾收集菌絲體，烘干，稱重，將其作為須癬毛癬菌的生物量。實驗重復3次。由表1 可知，與陰性對照組比較，TBF 組和HQD 各劑量組須癬毛癬菌生物量均顯著降低（P＜0.05），且HQD 高劑量組的生物量顯著低于HQD 低劑量組（P＜0.05）。

2.2.5 HQD對須癬毛癬菌菌絲超微結構的影響

實驗分為陰性對照組、TBF 組（0.062 5 μg/mL）和HQD 低、中、高劑量組（1.56、3.13、6.25 mg/mL）。首先，將濃度為5×103cfu/mL的須癬毛癬菌菌懸液在28 ℃下培養3 d，然后加入相應藥液，繼續培養5 d；過濾菌絲并用無菌蒸餾水洗滌后，置于2.5%戊二醛中固定過夜；取出固定后的菌絲，用磷酸鹽緩沖液漂洗、鋨酸固定、磷酸鹽緩沖液再漂洗、乙醇梯度脫水后，依次用丙酮和樹脂混合液（1∶0、3∶1、1∶1、1∶3）處理，純樹脂包埋，切薄片，經醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后使用透射電鏡觀察。由圖1（HQD低劑量組圖略）可知，陰性對照組須癬毛癬菌菌絲顯示出清晰和完整的細胞結構，具有典型的細胞核和線粒體等；與陰性對照組相比，各給藥組菌絲的細胞結構均受到了一定程度的破壞，HQD低劑量組菌絲部分線粒體內容物被破壞；TBF組和HQD中劑量組細胞核被破壞，線粒體腫脹，細胞內容物滲漏；HQD高劑量組菌絲高度空泡化，線粒體嚴重腫脹，細胞內容物流失嚴重。

圖1 各組須癬毛癬菌菌絲的透射電鏡圖

2.3 HQD的抗菌機制

2.3.1 HQD對須癬毛癬菌細胞壁的影響

同“2.2.1”項下方法測定在有/無0.8 mol/L 山梨醇時，HQD的MIC值（以CAS為陽性對照藥）。結果顯示，在無山梨醇的條件下，CAS的MIC為50 μg/mL，而在加入0.8 mol/L 山梨醇的條件下，CAS 的MIC 從50 μg/mL提高至200 μg/mL，表明CAS抗須癬毛癬菌的機制與細胞壁有關。而HQD 無論是否有山梨醇存在，其MIC 值均為3.13 mg/mL，表明HQD 可能對須癬毛癬菌細胞壁無作用。

2.3.2 HQD對須癬毛癬菌細胞膜的影響

同“2.2.5”項下方法培養、分組、給藥、收集濕菌絲體。稱取濕菌絲體約0.2 g，加入5 mL 新鮮配制的25%氫氧化鉀乙醇溶液（25 g KOH 和30 mL 無菌蒸餾水用100%乙醇稀釋至100 mL），渦旋混合5 min，然后參考文獻[11—12]方法測定須癬毛癬菌細胞膜中麥角固醇的含量。另外，同“2.2.5”項下方法培養、分組（另設置MCZ組作為檢測CYP51活性的陽性對照）、給藥、收集濕菌絲體，然后按相應試劑盒方法操作，檢測須癬毛癬菌細胞膜中SE和CYP51的活性。實驗重復3次。由表2可知，與陰性對照組相比，TBF 組和HQD 各劑量組須癬毛癬菌細胞膜中麥角固醇的含量均顯著降低（P＜0.05），且HQD的抑制作用呈劑量依賴性；TBF組和HQD中、高劑量組須癬毛癬菌細胞膜中SE 活性以及MCZ 組和HQD中、高劑量組須癬毛癬菌細胞膜中CYP51活性均顯著降低（P＜0.05），且MCZ組和HQD高劑量組須癬毛癬菌細胞膜中CYP51活性顯著低于HQD低劑量組（P＜0.01）。

表2 各組須癬毛癬菌中麥角固醇含量和SE、CYP51活性的檢測結果（±s，n＝3）

表2 各組須癬毛癬菌中麥角固醇含量和SE、CYP51活性的檢測結果（±s，n＝3）

a：與陰性對照組比較，P＜0.05；b：與HQD低劑量組比較，P＜0.01；c：與HQD中劑量組比較，P＜0.01；－：無相應數據。

組別陰性對照組TBF組MCZ組HQD低劑量組HQD中劑量組HQD高劑量組麥角固醇含量/（μg/g）419.04±16.98 296.16±14.51ab－366.18±11.82a 305.67±22.70ab 193.56±24.80abc SE活性629.29±55.77 424.15±52.24a－522.37±41.91 426.75±92.06a 375.47±56.83a CYP51活性319.54±41.21－204.38±23.64ab 274.22±23.34 241.38±27.27a 216.41±37.38ab

2.3.3 HQD 對須癬毛癬菌線粒體中MDH、SDH 及ATP酶活性的影響

同“2.2.5”項下方法培養、分組、給藥、收集濕菌絲體，提取線粒體，然后參考相應試劑盒說明書方法操作，檢測線粒體中MDH、SDH 及ATP 酶（鈉鉀ATP 酶、鈣鎂ATP 酶和總ATP 酶）的活性。實驗重復3 次。由表3 可知，與陰性對照組比較，TBF 組和HQD 中、高劑量組須癬毛癬菌線粒體中MDH、SDH、鈉鉀ATP 酶、鈣鎂ATP酶、總ATP酶活性均顯著降低（P＜0.05）；且相比HQD低劑量組，HQD 中、高劑量組的部分指標活性更低（P＜0.05）。

表3 各組須癬毛癬菌線粒體中MDH、SDH 及ATP 酶活性的檢測結果（±s，n＝3）

表3 各組須癬毛癬菌線粒體中MDH、SDH 及ATP 酶活性的檢測結果（±s，n＝3）

a：與陰性對照組比較，P＜0.05；b：與HQD低劑量組比較，P＜0.05；c：與HQD中劑量組比較，P＜0.05。

組別陰性對照組TBF組HQD低劑量組HQD中劑量組HQD高劑量組MDH 4.56±1.23 2.52±0.44a 3.59±0.72 2.57±1.57a 1.66±0.57ab SDH 17.46±2.17 10.33±0.64ab 13.88±1.28a 10.61±2.11ab 9.38±2.04abc鈉鉀ATP酶3.08±0.17 1.68±0.28a 2.22±0.72 1.63±0.72a 1.13±0.19ab鈣鎂ATP酶5.33±0.42 3.24±0.37ab 4.46±0.19 2.98±0.90ab 2.24±0.97abc總ATP酶11.67±1.23 7.99±1.94a 6.39±1.10 8.60±1.69a 6.39±1.10ab

3 討論

須癬毛癬菌可導致人體和動物各個部位感染，已成為第二大常見的皮膚癬菌，但現有治療藥物有限，且副作用大，因此從傳統中藥中尋找高效、低毒、低耐藥的天然抗真菌藥物具有重要意義。本研究發現，HQD對須癬毛癬菌的MIC和MFC值分別為3.13、25 mg/mL，且可顯著抑制須癬毛癬菌菌絲生長、孢子萌發和生物量的產生，表明HQD 可能是一種具有臨床應用前景的抗真菌藥物。

細胞壁可以保護細胞形態免受外部滲透沖擊，在沒有滲透穩定劑（山梨醇）的情況下，藥物可破壞細胞壁的完整性導致真菌細胞溶解，甚至死亡[13—14]。因此，山梨醇保護試驗可用于探索HQD 對真菌細胞壁是否有影響，若有影響，在含有山梨醇培養基中，HQD 的MIC 值將增大。而本研究中加入0.8 mol/L 山梨醇后，HQD 的MIC 值無變化，表明HQD 對須癬毛癬菌的細胞壁無作用。細胞膜是一種動態結構，由嵌入了酶和轉運蛋白的脂質雙分子層組成；麥角固醇是細胞膜的主要甾醇成分，不僅可參與調節細胞膜的通透性和流動性，還可維持細胞膜結構的完整性[15]。SE 是一種黃素腺嘌呤二核苷酸，其可催化角鯊烯環氧化為2，3-氧化角鯊烯，從而導致麥角固醇生物合成途徑的級聯反應；CYP51的阻斷可導致羊毛甾醇和其他14α-甲基化甾醇在真菌細胞膜中積累，從而導致膜通透性變化和膜蛋白功能障礙[12，16]。線粒體是ATP合成的主要細胞器，是細胞進行有氧呼吸的主要場所，其脫氫酶（包括MDH 和SDH）是ATP 生物合成中非常重要的酶[17]。基于此，筆者在抗真菌機制研究中，選擇不同的藥物作為陽性對照：（1）TBF能降低生物膜中麥角固醇含量，還能通過抑制SE 活性來抑制真菌細胞膜中麥角固醇的合成并影響線粒體酶活性[18]，因此，在麥角固醇含量測定、SE和MDH、SDH以及ATP酶活性檢測實驗中，筆者選擇TBF作為陽性對照藥物。（2）MCZ 作為CYP51 的抑制劑，可以與細胞色素P450 的血紅素鐵原子結合，阻止羊毛甾醇14α-甲基的氧化去除[19]，因此，在CYP51 活性測定實驗中，筆者選擇MCZ作為陽性對照藥物。（3）CAS可影響細胞壁完整性[20]，因此，本研究將其作為考察細胞壁完整性的陽性對照藥物。本研究發現，HQD對須癬毛癬菌細胞壁無作用，但是其可能通過降低麥角固醇含量和SE、CYP51 的活性影響須癬毛癬菌細胞膜，還可通過降低MDH、SDH、鈉鉀ATP酶、鈣鎂ATP酶和總ATP酶的活性影響須癬毛癬菌線粒體，進而發揮抗菌作用。

綜上所述，HQD 具有顯著的抗須癬毛癬菌活性，其作用機制與降低細胞膜中麥角固醇含量和SE、CYP51活性以及線粒體相關酶活性有關。