藍舌病新疆分離株VP7蛋白編碼基因序列分析及一步法RT-PCR方法的建立

馬曉菁,谷文喜,葉 鋒,劉 帥,劉麗婭,謝彩云,鐘 旗,易新萍

(新疆畜牧科學院獸醫研究所,烏魯木齊 830013)

0 引 言

【研究意義】藍舌病(Bluetongue,BT)由藍舌病病毒(Bluetonguevirus,BTV)引起,屬非接觸性傳染病,主要感染綿羊、牛等反芻動物。藍舌病病毒為呼腸病毒科(Reoviridae)環狀病毒屬(Orbivirus),藍舌病病毒亞群,是典型環狀病毒屬病毒。BTV存在大量基因、抗原變異且血清型眾多,不同血清型間交叉反應較低或無交叉免疫保護反應。目前已確定的BTV血清型為1-27型BTV,28型和29型BTV正在鑒定中[1-2]。BTV基因組全長19 219 bp,由10個大小不同的節段分別編碼7種結構蛋白(VP1-VP7)和4種非結構蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3a、NS4)[3-4], 其中由S3與S7基因編碼的VP3與VP7蛋白共同構成病毒粒子的內層衣殼。VP7蛋白占內衣殼蛋白的36%,以三聚體形式存在,在不同BTV血清型中同源性高達94%[5-6]。VP7蛋白是BTV血清學檢測中主要的群特異性抗原[7],常作為BTV血清學檢測的理想靶抗原。但不同地域BTV分離株S7基因序列出現差異[8],使得BTV分子生物學檢測及鑒定存在一定難度。【前人研究進展】YU等[9]在1988年完成了BTV-10的VP7基因全序列研究,并逐步分析了不同血清型VP7基因序列,研究結果確定了VP7蛋白作為群特異性抗原的分子基礎。馬洪超等[10]對BTV Z1株S7基因克隆并序列分析,序列分析結果可見VP7基因雖保守,但也存在較大的變化。李文超等[11]對BTV-5型S7基因序列比對分析,結果可見不同血清型S7基因ORF序列保守性相對較低,但其編碼的氨基酸序列高度保守。近年來對VP7蛋白研究主要集中在BTV檢測方法的建立,賈赟等[12]對BTV-25型VP7蛋白進行原核表達,結果表明VP7蛋白具有良好的免疫原性,為BTV蛋白芯片檢測方法建立提供技術支持。臧明鑫等[13]對BTV-25型VP7蛋白單克隆抗體識別位點進行鑒定,序列分析表明氨基酸序列QYHAM 在BTV不同血清型的間保守,為BTV疫苗設計及高通量檢測試劑盒研制奠定基礎。王慧煜等[14]建立BTV VP7抗體膠體金免疫層析檢測方法具有較好的特異性和穩定性,為藍舌病檢疫及監測提供快速篩查方法。孫雯等[15]原核表達BTV VP7蛋白,以純化的VP7蛋白作為包被抗原,建立BTV-14型間接ELISA檢測方法,可用于藍舌病流行病學調查。【本研究切入點】我國多地發現了BTV 抗體呈陽性的動物[16]。1986年新疆檢出山羊、綿羊以及牛均存在BTV血清學陽性[13],1990年分離到BTV,確診了新疆地區BTV存在[17]。2012年再次對新疆8個地(州)的8個縣(市)進行了BTV流行病學調查,結果顯示藍舌病在新疆地區仍然存在[18]。張玲等[19]在新疆尉犁縣監控動物群中分離獲得1株BTV-1型分離株。藍舌病病毒具有血清型眾多、變異快等特點,需進一步了解新疆地區BTV流行情況,建立快速診斷技術,控制其流行。【擬解決的關鍵問題】研究對1株藍舌病新疆分離株編碼VP7蛋白S7基因序列進行擴增,比對分析序列結果,設計引物,建立一步法RT-PCR方法,為新疆地區藍舌病鑒定及疫苗研制提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

2014年9月于新疆尉犁縣采集轉陽前1周綿羊全血提取藍舌病病毒RNA。牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)提取RNA、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)提取DNA以及BHK-21細胞提取RNA,-80℃保存,均由新疆畜牧科學院獸醫研究所布病室保存。

基因克隆載體PMD19-T、一步法RT-PCR試劑盒(Prime ScriptTMone step RT-PCR kit)均購自TaKaRa寶信生物工程(大連)有限公司,PCR mix購自北京莊盟公司,DNA回收純化試劑盒及質粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。反轉錄試劑盒(SuperScriptTMFirst-strand Synthesis System)購自Invitrogen公司,引物合成及測序服務由上海生工完成,二代測序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.2 方 法

1.2.1 分離株藍舌病NS1片段RT-PCR擴增

依照OIE手冊提供引物進行巢式PCR[20]擴增,第一輪擴增引物:FA(5’-3’):GTTCTCTAGTTGGCAACCACC;RB:(5’-3’):AAGCCAGACTGTTTCCCGAT; 第二輪擴增引物FC(5’-3’) :GCAGCATTTTGAGAGAGCGA;RD(5’-3’):CCCGATCATACATTGCTTCCT擴增產物片段分別為272和101 bp。取BTV新疆分離株提取RNA 5 μL,95℃變性5 min為模板,RT-PCR反應體系25 μL,其中模板5 μL ,2×1 step Buffer(Dye plus)12.5 μL,PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1 μL,上游引物FA(10 μM)0.5 μL,下游引物RB(10 μM)0.5 μL,ddH2O補足25 μL。第一輪擴增反應程序:45℃ 40 min,94℃ 2 min,1個循環;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s共40個循環;72℃延伸 5 min。以第一輪擴增產物為模板,進行第二輪擴增,反應體系為25 μL,其中模板1 μL,PCR mix 12.5 μL,上游引物FC(10 μM)1 μL,下游引物RD(10 μM)1 μL,ddH2O補足25 μL。反應程序:94℃預變性 1 min,94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 20 s共35個循環,72℃延伸5 min,擴增產物送上海生工測序。

1.2.2 BTV新疆分離株S7基因序列獲得

參照二代測序方法[21]將BTV新疆分離株提取RNA,按照反轉錄試劑盒程序反轉錄為cDNA,其中RNA 11 μL,引物(Radom Hexamer Primer 600 pmol/μL)2 μL,65℃ 10 min,然后體系中加入Transcriptor Reverse Transcripase Reaction Buffer(5×)4 μL;Protector RNase Inhibitor(40 U/μL)0.5 μL;Deoxynucleotide Mix (10 mM)2 μL;Transctiptase(20 U/μL)0.5 μL;RNase Out(40 U/μL)1 μL,25℃ 10 min,50℃ 50 min,85℃滅活5 min,立即冰浴,反轉錄cDNA送公司測序。測序結果與GenBank中已發表S7基因片段序列進行Blast比對,并利用軟件MEGA5.0對序列進行差異分析。

1.2.3 BTV新疆分離株S7基因一步法RT-PCR方法的建立

1.2.3.1 分離株S7基因RT-PCR擴增

以分離株S7基因保守序列,利用軟件Oligo6.0設計引物,篩選出擴增BTV新疆分離株S7基因RT-PCR特異性引物。取BTV新疆分離株提取RNA 5 μL,95℃變性5 min為模板,RT-PCR反應體系25 μL,其中模板5 μL ,2×1 step Buffer(Dye plus)12.5 μL,PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1 μL,上游引物F-7X(10 μM)0.5 μL,下游引物R-7X(10 μM)0.5 μL,ddH2O補足25 μL。反應程序:45℃ 40 min,94℃ 2 min,1個循環;94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s共40個循環;72℃延伸10 min,PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。表1

表1 一步法RT-PCR擴增引物

1.2.3.2 一步法RT-PCR特異性

分別以BTV新疆分離株、牛病毒性腹瀉病毒以及牛傳染性鼻氣管炎病毒提取RNA、DNA為模板,采用一步法RT-PCR方法擴增S7基因,以BHK-21細胞提取RNA作為陰性對照。

1.2.3.3 一步法RT-PCR敏感性

以BTV新疆分離株提取RNA為模板,進行S7基因片段RT-PCR擴增,產物經瓊脂糖凝膠電泳,目的片段膠回收,并連接pMD19-T載體構建重組質粒,提取質粒測定濃度。分光光度儀測定BTV新疆分離株S7基因片段重組質粒濃度,利用公式(1),計算標準質粒拷貝數。10倍系列稀釋重組質粒,進行RT-PCR擴增。

拷貝數(copies/L)=[6.02× 1023×質粒質量濃度(ng/mL)× 10-9]/[DNA長度(bp)× 660].

(1)

2 結果與分析

2.1 分離株NS1片段擴增結果

研究表明,兩輪PCR產物分別出現272和101 bp目的條帶,分離株與GenBank數據庫中藍舌病病毒編碼NS1蛋白基因相似性為98.04%,為藍舌病病毒分離株。圖1

注：M:DNAMarkerDM2000;1-2:BHK 細胞提取RNA;3-4:BTV新疆分離株提取RNA

2.2 BTV新疆分離株S7基因序列

研究表明,新疆分離株S7基因序列與中國哈爾濱報道新疆BTV分離株S7基因片段相似度較高為89.64%,與中國云南報道新疆BTV-29型分離株、蒙古國BTV分離株S7基因片段相似度分別為87.49%和87.39%,與德國BTV分離株S7基因片段相似度為80.70%。

BTV我國新疆分離株S7基因序列與我國云南報道新疆BTV分離株S7基因序列(GenBank號:KX695176.1)、我國哈爾濱報道新疆BTV分離株S7基因序列(GenBank號:KX695176.1)以及蒙古國BTV分離株S7基因序列(GenBank號:LR877353.1)、德國BTV分離株S7基因序列(GenBank號:LR798447.1)比對,A/G堿基差異5處,T/C堿基差異9處,G/A堿基差異7處,C/T堿基差異4處,T/A堿基差異1處,共9處差異。232位氨基酸S氨基酸酸序列位氨基酸L氨基,272、290位氨基酸I氨基,297位氨基酸H氨基酸酸序列位氨基酸T氨 1 313位氨基酸L氨 S,316位氨基酸C氨基,324位氨基酸S→L。

2.3 BTV新疆分離株S7基因一步法RT-PCR擴增結果

2.3.1 一步法RT-PCR特異性

研究表明,PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳,僅BTV新疆分離株提取RNA擴增出1 010 bp目的條帶,BVDV和IBRV分離株均未出現擴增條帶。圖2

注：M:DNAMarkerDL2000; 1:BHK細胞提取RNA;2:ddH20空白對照; 3:牛病毒性腹瀉病毒提取RNA;4:牛傳染性鼻氣管炎病毒提取DNA;5:BTV新疆分離株提取RNA

2.3.2 一步法 RT-PCR敏感性檢測結果

研究表明,BTV新疆分離株S7基因片段重組質粒濃度為168.57 ng/μL,計算標準質粒拷貝數,以4×105～4×100copies/μL進行RT-PCR擴增,該方法敏感性為4×103copies/μL。圖3

注：M:DNAMarkerDL2000;1:BHK細胞提取RNA;2:標準質粒4×106copies/μL;3:標準質粒4×105copies/μL;4:標準質粒4×104copies/μL;5:標準質粒4×103copies/μL;6:標準質粒4×102copies/μL

3 討 論

3.1在我對國牛羊藍舌病開展血清學調查中,新疆地區BTV抗體陽性率為14.91%[22],2016～2020年新疆地區共分離到3個血清型毒株[18,23-24],分別為BTV-1型、BTV-14以及 BTV-29型,其中BTV-1為我國主要流行血清型之一,BTV-14型與BTV29型僅在新疆分離獲得。研究中BTV中國新疆分離株編碼VP7蛋白S7基因序列與蒙古國、德國BTV毒株VP7片段同源性分別為87.39%和80.70%,僅次于BTV-29型。檢測到BTV-14型弱毒疫苗病毒[25]。

3.2BTV基因組包含10個分子質量不同的雙鏈RNA,基因重配是基因組分節段RNA病毒進化的主要動力,可發生在任意一個節段上,使BTV呈現出高度的遺傳多樣性[26],并在在一定程度上反應出BTV的地理起源[27]。VP7蛋白是BTV的主要核心粒子,常作為BTV血清學檢測理想靶抗原以及新型疫苗主要研究對象[28]。在對與中國新疆分離株具有同源性的S7基因序列間核苷酸與氨基酸比對分析,序列間存在核苷酸差異26處,氨基酸差異9處。

對BTV基因片段的克隆和序列分析,是追蹤新毒株地域來源,以及分子流行病學調查的可靠方法之一,也是研究病毒遺傳變異,親緣關系的有效手段[10]。

4 結 論

BTV中國新疆分離株與國內BTV主要流行血清型S7基因序列差異較大,以BTV中國新疆分離株S7基因片段保守序列設計引物,建立的一步法RT-PCR鑒定方法,該方法具有良好的特異性和敏感性,敏感性為4×103copies/μL。