烏拉爾甘草不同組織可培養內生菌分離篩選及產β-葡萄糖苷酶菌株初篩

孔曉雙,魏 然,董應宏,侯 敏,買爾哈巴·艾合買提,侯新強,楊文琦,崔衛東

(1.新疆大學生命科學與技術學院,烏魯木齊 830052;2.新疆農業大學農學院,烏魯木齊 830052;3.新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】烏拉爾甘草(GlycrrhizauralensisFisch)屬于藥食同源植物。甘草藥理功效廣泛,具有抗菌、抗炎、抑菌等生物活性。甘草中活性成分的生成與其內生菌有很大的關聯[1]。植物內生菌是指生活的一定或全部階段生存于健康植物組織及器官內部的真菌、細菌、放線菌[2]。內生菌與植株存在著共生關系,參與宿主植物的生理或代謝過程,直接或間接轉化植物代謝物[3-4]。藥用植物內生菌擁有完整且龐大的產酶體系,代謝產物可轉化植物體內黃酮糖苷、皂苷等化合物,進而提高活性物質的含量,影響藥用植物的藥效[5-6]。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,EC3.2.1.21),也稱為纖維二糖酶,屬于水解酶類,主要水解化合物末端的非還原性β-D-葡萄糖苷鍵,從而釋放出β-D-葡萄糖和配基,是纖維素酶系中的三種組成成分之一,可協同降解纖維素為葡萄糖單元[7],其酶活力高低直接影響到纖維素酶的總體酶活力,且主要應用在木質纖維素材料水解及轉化黃酮糖苷增加其生物活性等方面[8-9]。【前人研究進展】目前,利用微生物,尤其是植物內生菌對黃酮以及皂苷類化合物進行轉化已成為研究的熱點,β-葡萄糖苷酶通過水解化合物末端的非還原性β-D-葡萄糖苷鍵來產生苷元形式的活性成分。上官修蕾等[10]利用從茯茶樣品中分離的“金花”菌所產的β-葡萄糖苷酶發酵豆粕轉化大豆異黃酮苷元;于潔[11]從中藥虎杖中分離的內生真菌AspergillusaculeatusHZ001產生的β-葡萄糖苷酶將虎杖苷轉化為白藜蘆醇,有較高的轉化率;Jxa等[12]以淫羊藿苷底物,利用菌株Ignitsphaeraaggregans的β-葡萄糖苷酶轉化制備生物活性更高的寶藿苷I;從人參中分離的252株內生細菌中,發現98株(38.88%)有β-葡萄糖苷酶活性,可以將人參皂苷轉化為稀有人參皂苷[13]。【本研究切入點】β-葡萄糖苷酶來源廣泛,在自然界中普遍存在于動物、植物、微生物中。其中β-葡萄糖苷酶主要來自霉菌、酵母菌和細菌等[14]。由于大多菌株存在產酶量少,活性低、特異性不強,限制了其在食品、化工以及生物醫藥方面的應用[15]。植物內生菌多樣性豐富,是β-葡萄糖苷酶的良好來源。目前關于甘草內生菌產β-葡萄糖苷酶研究報道較少,需研究在分離與甘草生物相容性好的內生菌的基礎上,篩選高產β-葡萄糖苷酶菌株,以期挖掘高效轉化甘草活性成分的菌種資源。【擬解決的關鍵問題】分析烏拉爾甘草不同部位可培養內生菌的組成和數量及對產β-葡萄糖苷酶的內生菌進行初篩,研究甘草可培養內生菌在甘草不同部位分布規律以及產β-葡萄糖苷酶的菌株在甘草組織部位中的分布,為甘草內生菌的資源開發及在內生菌中篩選高產β-葡萄糖苷酶菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品采集

新鮮健康的烏拉爾紅皮甘草于2021年秋季采自新疆阿勒泰地區,放置采樣袋中帶回實驗室,4℃條件下保存。

1.1.2 培養基

營養肉湯培養基NB(g/L):蛋白胨10.0、牛肉浸出粉3.0、氯化鈉5.0;

營養瓊脂培養基NA(g/L):蛋白胨10.0、牛肉浸出粉3.0、氯化鈉5.0、瓊脂20.0;

胰蛋白胨大豆肉湯TSB(g/L):胰蛋白胨17.0、大豆蛋白胨3.0、磷酸氫二鉀3.0、氯化鈉5.0、葡萄糖2.5;

胰蛋白胨大豆瓊脂TSA(g/L):胰蛋白胨17.0、大豆蛋白胨3.0、磷酸氫二鉀3.0、氯化鈉5.0、葡萄糖2.5、瓊脂20.0;

馬鈴薯葡萄糖水培養基PDB(g/L):馬鈴薯浸粉6.0、葡萄糖20.0、pH(5.6±0.2);

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基PDA(g/L):馬鈴薯浸粉6.0、葡萄糖20.0、瓊脂20.0、pH(5.6±0.2);

七葉苷固體培養基(g/L):蛋白胨10.0、酵母粉3.0、Nacl 3.0、七葉苷1.0、檸檬酸鐵0.5、瓊脂粉20.0。

1.1.3 試劑與儀器

七葉苷、檸檬酸鐵:上海源葉生物科技有限公司;細菌DNA提取試劑盒、真菌DNA提取試劑盒:新疆科遞源生物科技有限公司;β-葡萄糖苷酶試劑盒(微量法):蘇州科銘生物技術有限公司;96孔培養板:Corning Incorporated公司;恒溫培養箱(ZWY型):上海福瑪實驗設備有限公司;搖床(BSD-YX3200型):上海博迅醫療生物儀器公司;離心機(Presoo17型):上海博迅醫療生物儀器公司;酶標儀、PCR擴增儀(TC-XP型):杭州博日科技有限公司;電泳儀:美國伯樂BIO-RAD公司;凝膠成像系統(GELDOC Go型):上海艾研生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 甘草內生菌的篩選

1.2.1.1 甘草表面消毒

取烏拉爾紅皮甘草植株用自來水沖洗干凈,切成適中的小段,在無菌操作臺中進行表面消毒:無菌水沖洗3次,75%乙醇中浸泡3 min,無菌水沖洗1 min;5%次氯酸鈉溶液中浸泡5 min,無菌水沖洗1 min;用75%乙醇漂洗30 s,無菌水沖洗1 min,備用[16]。取最后1次無菌水洗滌上清液100 μL,涂布于NA、TSA和PDA培養基,做3個空白對照,分別放入35和28℃培養1～5 d,若觀察不到菌落生長則甘草表面消毒徹底。

1.2.1.2 甘草內生菌分離純化

取消毒完畢的甘草主根、須根、莖、葉,分別用無菌破碎機勻漿,取組織勻漿液移入含10% NB、10%TSB、10% PDB培養基中,稀釋2 000×、6 000×、18 000×后加入96孔培養板中,細菌35℃,真菌28℃培養[17],挑取長出的菌連續轉接在NA、TSA、PDA培養基上直至得到純化菌株。

1.2.1.3 甘草內生菌的鑒定

挑取純化后的單菌落接種于營養肉湯液體培養基中,35℃、150 r/min搖床培養18 h。4℃、5 000 r/min離心5 min后取沉淀菌體,按照細菌DNA提取試劑盒操作步驟提取甘草內生細菌的DNA。采用16S rRNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTACGACTT-3′)分別作為正向和反向引物進行擴增。內生真菌接種在馬鈴薯葡萄糖水培養基中 28℃、150 r/min 搖床培養 5 d。4℃、8 000 r/min 離心5 min 后收集菌體,加入液氮迅速研磨成粉,按照真菌DNA提取試劑盒操作步驟提取甘草內生真菌的DNA。真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) 和 ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGAATGC-3′)進行擴增。PCR產物采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗,將有條帶的PCR產物送上海生工進行測序。將細菌和真菌的測序結果分別在EzBioCloud數據庫(https://eztaxon-e.ezbiocloud.net)和NCBI數據庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與已知模式菌株序列比對,選擇相似度較高的菌株序列,利用MEGA7.0軟件鄰接法(neighbor-joining method)構建系統發育樹,校驗值bootstrap設置為1 000,將構建好的進化樹文件上傳iTol網站(https://itol.embl.de)上完善進化樹。

1.2.2 產β-葡萄糖苷酶內生菌的篩選

1.2.2.1 產β-葡萄糖苷酶內生菌的初篩

β-葡萄糖苷酶內生菌的篩選利用七葉苷顯色原理,即七葉苷被β-葡萄糖苷酶水解后生成的6,7-二羥香豆素(也稱七葉苷元),可以與鐵離子反應,培養基上的菌落周圍會生成黑褐色物質。將純化后的甘草內生菌重新劃線至七葉苷固體培養基上培養一段時間后觀察顏色變化,菌株劃線附近的培養基變黑,即該菌株能產β-葡萄糖苷酶[18]。

1.2.2.2 產β-葡萄糖苷酶內生菌的復篩

將在七葉苷培養基上出現顏色反應的細菌接種到營養肉湯培養基中35℃、180 r/min培養24 h,真菌接種到馬鈴薯葡萄糖水培養基中28℃、150 r/min培養5 d。將培養好的菌株發酵液于4℃、8 000 g離心10 min,取上清液即為粗酶液。按照β-葡萄糖苷酶活性檢測試劑盒提供的方法測定菌株產酶活性。

β-葡萄糖苷酶的酶活定義:樣本在37℃條件下每分鐘產生1 nmol對硝基苯酚定義為一個酶活性單位U。

1.3 數據處理

采用Excel 2019對試驗數據進行整理、分析與作圖,采用SPSS 24.0進行統計軟件進行單因素方差分析,多重比較采用最小顯著差異法(LSD)。數據進行3 次重復試驗,結果以“平均值±標準差(X±SD)”表示。

2 結果與分析

2.1 甘草不同組織部位可培養內生菌的分布

研究表明,從烏拉爾甘草主根、須根、莖、葉中分離到內生菌共48株,其中內生細菌33株,內生真菌15株。從甘草主根、莖兩個部位中分離的內生細菌一樣多,占比27.3%;定殖在須根和葉的比例分別為24.2%、21.2%。內生真菌在主根、須根、莖、葉中定殖的比例分別為53.3%、6.7%、26.7%、13.3%。內生細菌在主根和莖部密度最大,數量最多,其次是須根,葉中的內生細菌次之。內生真菌在主根中定殖的數量最多,與其他部位分離到的真菌菌株相比有顯著差異,其次是莖部和葉部,須根中真菌數量最少。表1

表1 甘草不同部位內生菌分離結果

2.2 甘草可培養內生細菌的分離鑒定

研究表明,甘草內生細菌在主根部分離得到4個屬,分別是芽孢桿菌屬(Bacillus)、虛擬芽孢桿菌屬(Fictibacillus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、詹森桿菌屬(Janthinobacterium);須根分離獲得3個屬,分別是芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、農桿菌屬(Agrobacterium);莖部分離到3個屬,分別是芽孢桿菌屬(Bacillus)、虛構芽胞桿菌屬(Fictibacillus)、Metabacillus屬;葉部分離到3個屬,分別是芽孢桿菌屬(Bacillus)、詹森桿菌屬(Janthinobacterium)、Niallia屬。甘草內生細菌在不同組織中多樣性表現為主根>須根=莖=葉。表2

表2 甘草內生細菌的基因序列

研究表明,33株甘草內生細菌隸屬于8個屬。Bacillus屬菌株數量最多,共有23株,占比總數的69.7%,在各組織中都有分布;Fictibacillus屬3株,占比9.1%、Janthinobacterium屬2株,占比6.1%;Acinetobacter屬1株,占比3.0%;Pseudomonas屬1株,占比3.0%;Agrobacterium屬1株,占比3.0%;Metabacillus屬1株,占比3.0%;Niallia屬1株,占比3.0%。芽孢桿菌屬是甘草內生細菌的優勢菌群,且甘草主根部位的內生細菌多樣性最高。圖1

圖1 甘草內生細菌的 16S rDNA 的 系統進化

2.3 甘草可培養內生真菌的分離鑒定

研究表明,甘草主根部分離獲得5個屬真菌,分別是青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、枝孢屬(Cladosporium)、鏈格孢屬(Alternaria)、聚端孢霉屬(Trichothecium);莖部分離到4個屬,分別是小脆柄菇屬(Candolleomyces)、青霉屬(Penicillium)、枝孢屬(Cladosporium)、曲霉屬(Aspergillus);葉部分離到2個屬,分別是青霉屬(Penicillium)、枝孢屬(Cladosporium);須根分離得到1個屬,為鐮刀菌屬(Fusarium)。甘草內生真菌在不同組織中多樣性表現為主根>莖>葉>須根。表3

表3 甘草內生真菌的基因序列

15株甘草內生真菌隸屬于7個屬。Cladosporium屬4株,占比26.7%;Penicillium屬3株,占比20.0%;Aspergillus屬3株,占比20.0%;Alternaria屬2株,占比13.3%;Trichothecium屬1株,占比6.7%;Candolleomyces屬1株,占比6.7%;Fusarium屬1株,占比6.7%。枝孢屬是甘草內生真菌的優勢菌群,且甘草主根部位的內生真菌多樣性最高。圖2

注：不同小寫字母表示內生細菌或內生真菌的酶活有差異性顯著(P<0.05)

圖2 甘草內生真菌的ITS- rDNA 的 系統進化

2.4 產β-葡萄糖苷酶內生菌的篩選

研究表明,有3株細菌和3株內生真菌的產酶黑色沉淀圈較為明顯。8株內生細菌經過營養肉湯培養基發酵24 h、4株內生真菌經馬鈴薯葡萄糖水培養基發酵5 d后,取上清液對其進行酶活力測定。12株菌株經發酵后,A12、A15、A17、A29、A30、A31、A65、A78、P9、P11、P16、P17的酶活力平均值分別為0.53、3.51、0.48、1.29、0.85、1.51、3.69、5.64、4.01、1.23、2.84、2.69 U/mL。產黑色沉淀圈較大的6株內生菌的酶活力也較高,與另外6株菌株相比酶活力有顯著差異。6株菌株酶活力較高的菌株經鑒定后3株內生細菌均為芽孢桿菌屬,分別為A15(Bacillusamyloliquefaciens)、A65(Bacillussubtilis)、A78(Bacillusrugosus)。3株內生真菌分別為P9(Candolleomycescandolleanus)、P16(Aspergillusfumigatus)、P17(Cladosporiumperangustum)。12株產β-葡萄糖苷酶菌株中分離自根部位的有5株,占比41.7%。分離自莖、葉、須的比例分別為33.3%、16.7%、8.3%,產酶的菌在根部位分布最多。圖3,圖4

圖3 七葉苷平板初篩產β-葡萄糖苷酶菌株

3 討 論

3.1近年來圍繞甘草內生菌的相關研究逐步增多,甘草內生菌的研究來源主要是烏拉爾甘草、脹果甘草[19]。不同的品種、產地、生態環境、組織部位(根、莖、葉)等因素對甘草內生菌組成有很大的影響[20]。陳靜等[21]從5個地區的129株烏拉爾甘草樣品中共分離到 438 株內生真菌,結果顯示不同產地甘草內生真菌群落組成也各不相同。甘肅、新疆和內蒙古都以鐮孢屬和曲霉屬為優勢菌屬,而寧夏和北京是以鐮孢屬為優勢菌屬。張燃等[22]對寧夏野生和種植甘草的內生菌進行分離,結果表明野生甘草內生菌數量與多樣性都明顯高于種植甘草。Li等[23]從新疆3個不同地區的烏拉爾甘草中共分離116株內生細菌,隸屬于20個屬,根組織中14個屬,高于莖12個屬和葉組織6個屬。內生菌的分布規律與宿主本身的特性及內生菌的種類相關,在植物的不同組織部位具有不同分布和結構[24],因為不同植物組織中的結構和營養不同,不同內生菌的營養需求也不相同,這影響了內生菌定植、生長和分布[25]。

Liu等[26]研究發現青蒿根內生真菌的數量、定植率和分離率顯著高于莖和葉,從根中分離的內生真菌的酶活性顯著高于從莖和葉中分離的真菌,內生真菌的代謝功能在組織間存在顯著差異。試驗共分離12株產β-葡萄糖苷酶甘草內生菌,在甘草組織的分布比例大小順序依次為主根41.7%,莖33.3%、葉16.7%、須8.3%。產酶的菌在根部位分布的最多,甘草的主根為其藥效部位,β-葡萄糖苷酶作為一種水解酶可參與活性物質的轉化和修飾,進而提高植物體內活性物質含量和藥用價值[27]。

3.2張琴等[28]以新疆脹果甘草為材料,從甘草內生菌中分離的兩株高產β-葡萄糖苷酶的菌株均來源根部位,經鑒定兩株菌分別是泡盛曲霉和構巢曲霉,酶活力分別為18.63、18.04 U/mL,兩株菌對甘草黃酮轉化后的抗氧化活性均有顯著增加;Huang等[29]從喜樹種子中分離到一株產β-葡萄糖苷酶的新菌株花色曲霉,經響應面法優化發酵后的β-葡萄糖苷酶活性為812.86 U/mL,可高效降解纖維素;劉姜華[30]從槐角粉中分離純化一株產β-葡萄糖苷酶的菌株為米根霉,經發酵后酶活力達到1.16 U/mL,該酶將槐角苷轉化為染料木素的轉化得率為80.2%;Tam等[31]從人參屬植物的根、莖和葉中分離出27株β-葡萄糖苷酶試驗陽性的菌株,4株酶活性較高的菌株,其中蒼白桿菌Ochrobactrumsp.酶活最高為1.83U/L,用于進一步研究人參皂苷Rb1向人參皂苷Rd和Rg3的生物轉化。目前植物內生菌中產β-葡萄糖苷酶的菌株多集中在真菌曲霉屬和少部分的細菌,且普遍真菌酶活較高。與其他從藥用植物中分離的內生細菌的報道一致[32-33]。試驗獲得的一株芽孢桿菌BacillusrugosusA78,酶活優于其他真菌菌株,最高為5.64 U/mL。而且芽孢桿菌具有易培養、生長周期短的特點,后期通過優化菌株發酵條件提高產酶活性,可以進一步提升β-葡萄糖苷酶在工業上的應用潛力。

4 結 論

共獲得純化內生菌48株,其中,內生細菌33株,內生真菌15株。內生細菌在主根和莖部分布最多,芽孢桿菌屬是甘草組織中的優勢細菌屬,內生真菌在主根中定殖的數量最多,枝孢屬是甘草內生真菌的優勢菌屬。根部可能是甘草內生菌寄生或共生的主要組織部位。篩選獲得12株產β-葡萄糖苷酶的菌株,有6株酶活較高,其中BacillusrugosusA78菌株酶活最高為5.64 U/mL。產β-葡萄糖苷酶的菌株在主根組織部位分布的最多,占比41.7%,是選育產酶菌株的優勢部位。